| 在17个供试群体中，引物CmTCR10（NED）共检测到78个等位基因，平均每个群体为4.6个；引物CmTCR24共检测到41个等位基因SSR，平均每个群体为2.4个。本试验CmTCR10常规引物扩增产物PAGE银染图谱中，仅在新庙野板栗群体中检测出4个等位基因（图1，第2泳道）；利用ABI全自动遗传分析仪对同一样本进行分析，可以清晰地检测出5个等位基因（图2-A）。同时可以在Genotyper中准确地输出片段大小及与扩增产物丰度相对应的峰高值（表3）。
用Genotyper输出数据，用R软件的FREQS-R模块，计算了西祥沟无花等9个群体（CmTCR24）及柞红栗等8个群体（CmTCR10）的混和取样等位基因频率（表4）。其中等位基因频率最小值为柞红栗的等位基因10（199bp），频率为0.045。基因频率最高的为遵达栗的等位基因2（179 bp），达到0.855。分析表明，通过对产物的定量分析，可以获得混和样本中各个等位基因的频率。
图2 新庙野板栗群体荧光引物组合CmTCR10(NED)与CmTCR21(HEX)多重PCR产物在ABI3700 GeneScan检测图谱
Fig.2 GeneScan profile of the multiplex PCR in xinmiaowild chestnut with fluorescent primer CmTCR10(NED) and CmTCR21(HEX) in ABI3700DNA Analyzer
A: CmTCR10 (NED +ROX500), CmTCR10 (Blue NED + Red Size standard ROX500); B: CmTCR21 (HEX +ROX500), CmTCR21 (Black HEX + Red Size standard ROX500); C: CmTCR10 + CmTCR21 /M-CAT + 内标(复合图谱), CmTCR10+ CmTCR21 + Size standard ROX500 (Multi-profile)
表3 新庙野板栗群体多重PCR分析结果
Table 3 Results from Genotyper data of multiplexPCR in xinmiao wild chestnut in ABI3700 DNA Analyzer
|
引物Primers
|
检测通道颜色Detection color
|
等位基因Alleles
|
片段大小Size /bp
|
峰高Peakheight
|
|
CmTCR10
CmTCR21
分子量
内标
Molecular
Size standard
|
蓝色Blue
B
黑色Black
HEX
红色Red
O
|
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
|
177
189
195
206
212
152
158
167
175
184
189
201
209
215
165
169
176
180
187
192
194
203
208
219
|
93
2316
655
146
4350
379
157
361
74
5348
66
943
97
1352
201
249
177
246
1452
61
734
2145
146
457
|
表4 板栗群体混和取样等位基因分布及其频率①
Table 4 The alleles and their frequencies were analyzedwith bulk sampling in chestnut populations
|
名称
Name
|
引物
Primer
|
Allele 1
|
Allele 2
|
Allele 3
|
Allele 4
|
Allele 5
|
Allele 6
|
Allele 7
|
Allele 8
|
Allele 9
|
Allele 10
|
Allele 11
|
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
FS
|
f
|
|
西祥沟无花Xixianggou wuhua
新庙野板栗Xinmiao wild chestnut
辽丹58 Liaodan 58
大公书4号Dagongshu 4
东密坞无花Dongmiwu wuhua
燕昌Yanchang
炮车2号Paoche 2
处暑红Chushuhong
官厅10号Guanting 10
柞红栗Zhahongli
燕红Yanhong
遵达栗Zundali
辽丹61 Liaodan 61
菜西大油栗Laixi dayouli
大早熟Dazaoshu
短扎Duanzha
上丰Shangfeng
|
CmTCR24
CmTCR10
|
-
-
199
-
-
199
-
-
-
176
-
-
-
176
-
-
-
|
-
-
0.535
-
-
0.155
-
-
-
0.375
-
-
-
0.325
-
-
-
|
204
-
-
204
-
-
-
204
-
-
-
179
-
-
-
-
-
|
0.375
-
-
0.815
-
-
-
0.185
-
-
-
0.855
-
-
-
-
-
|
-
-
-
-
207
-
207
207
-
-
181
-
-
-
-
181
-
|
-
-
-
-
0.165
-
0.325
0.560
-
-
0.525
-
-
-
-
0.200
-
|
211
211
-
-
-
-
-
-
211
-
-
-
182
-
-
-
-
|
0.325
0.285
-
-
-
-
-
-
0.275
-
-
-
0.525
-
-
-
-
|
-
-
-
212
-
212
-
-
-
185
-
-
-
185
-
-
-
|
-
-
-
0.185
-
0.425
-
-
-
0.225
-
-
-
0.675
-
-
-
|
214
-
-
-
-
214
-
-
-
-
-
-
-
-
188
-
188
|
0.300
-
-
-
-
0.420
-
-
-
-
-
-
-
-
0.105
-
0.775
|
-
-
-
-
-
-
-
215
-
-
-
-
-
-
-
191
-
|
-
-
-
-
-
-
-
0.255
-
-
-
-
-
-
-
0.800
-
|
-
218
-
-
218
-
-
-
-
194
194
-
-
-
194
-
-
|
-
0.715
-
-
0.835
-
-
-
-
0.355
0.085
-
-
-
0.605
-
-
|
-
-
219
-
-
-
219
-
-
-
-
195
195
-
-
-
195
|
-
-
0.465
-
-
-
0.675
-
-
-
-
0.145
0.475
-
-
-
0.225
|
-
-
-
-
-
-
-
-
221
199
-
-
-
-
199
-
-
|
-
-
-
-
-
-
-
-
0.725
0.045
-
-
-
-
0.290
-
-
|
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
203
-
-
-
-
-
-
|
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0.390
-
-
-
-
-
-
|
① FS：片段大小Fragmentsize；f：等位基因频率Allelicfrequency；等位基因：Allele
3 讨论
本研究基于ABI全自动遗传分析仪（ABI3700 DNA Analyzer）的荧光SSR片段大小的分析技术有效地解决了上述问题。可以准确地读出每个等位基因片段的大小，有利于不同批次样品等位基因分析的数据统一；高度自动化与程序化，操作更为简便，省时省力论文下载。ABI3700或ABI3730毛细管型自动测序仪和与之匹配的软件直接进行程序化、数据化和图像化处理；可以精确定量扩增产物，该系统依据定量PCR原理SSR，对PCR产物乃至模板DNA中某一基因型进行定量分析。在等位基因频率、SSR定量分析方面有广阔的应用前景；效率更高，分析通量大。通过多重PCR，还可进一步提高效率。
前人的研究表明15～20个单株可以较好地代表一个群体[9,13-14]。常规的SSR技术由于不能定量，只能通过分别提取单株DNA，分别扩增，分析群体内的基因频率，然后比较群体间的基因频率。以15个群体，每个群体取15个单株，60对引物计算，单株取样法需提取225份DNA，13500个SSR-PCR反应，还有大规模的PAGE银染工作量。用混和取样法，只需提取15份DNA，900个SSR-PCR反应SSR，是前者工作量的6.67％。而且，应用ABI全自动遗传分析仪，自动化程度高，总体效率是前者的30倍以上，如果应用上述多重PCR技术，效率还会进一步提高。更重要的是，荧光SSR分析技术还具有读带精确，数据格式一致，不存在数据整合的障碍。
致谢：衷心地感谢澳大利亚南澳洲发展研究所基因研究中心Klaus Oldach博士在数据处理方面提供的帮助。
参考文献References:
[1]Huang H W, Dane F, Kubisiak T Land Huang H W. Allozyme and RAPD analysis of genetic diversity and geographicvariation in wild populations of the American chestnut (Fagaceae) [J]. AmericanJournal of Botany, 1998, 85: 1013-1021.
[2]BAO Zhao-xia, HUANG Hong-wen.Analysis of genetic diversity and genetic relationships of Chinese chestnut[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2002, 29 (1): 13-19.
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