论文导读:：在细胞全能性学说的基础上，以草莓为试材，MS为基本培养基，研究不同的离体培养条件下诱导草莓未受精子房雌核发育的情况，寻求高频率诱导草莓雌核发育的条件。本研究采用单因子比较实验法，分析比较了不同基因型、外源激素种类和浓度、蔗糖浓度、低温预处理的时间、生长环境及发育状况、温度和光照条件六个关键因素对诱导草莓雌核发育的影响。试验结果表明：选择合适的基因型的露地栽培苗的一级花蕾，4℃低温预处理48h，接种于含6%蔗糖和0.8%琼脂的MS基本培养基中附加2.0 mg/L的外源激素 2,4-D的诱导培养基上，在每12h变温(25℃／16℃) 且连续黑暗的条件下培养最容易诱导草莓未受精子房雌核发育获得单倍体胚囊植株。本研究为草莓倍性育种提供参考。
论文关键词：草莓，未受精子房，雌核发育，离体培养
未受精子房或胚珠离体培养是人工诱导形成单倍体植株的技术之一。与花药培养相比，经未受精子房或胚珠离体培养诱导的单倍体植株至少有四个独特的优点：(1)有些植物花药培养至今难以成功或诱导率太低，而未受精子房或胚珠离体培养可提供一条单倍体育种新途径：(2)对于雄性不育的植物无法用花药来培养获得单倍体，可采用未受精子房或胚珠培养来诱导；(3)未受精子房或胚珠培养的后代能产生较多的绿苗[1]；(4)培养地方品种或杂种一代的未受精胚珠或子房，可迅速获得高纯度种质资源，在高效率利用种质资源、提高选育效果方面有理论研究和实际应用价值。近年来国内外学者在此方面做了许多探索性工作，到目前为止相继有25种，2变种植物通过未受精胚珠或子房的离体培养，获得了单倍体植株。但在果树中至今没有未受精子房或胚珠离体培养的报道[2]。
草莓是蔷薇科草莓属(Fragaria)多年生草本雌核发育，是世界许多国家广泛栽培的一种浆果类植物。上世纪60年代以来草莓的离体培养研究和应用颇受重视，各种器官、组织和细胞的培养迅速发展，开展了包括茎尖培养、花药培养、抗性体细胞无性系筛选、基因转化等方面的研究，并取得了一定的进展[3，4]。1998年Ahokas用秋水仙素、二甲基亚砜、甘油处理二倍体和四倍体草莓体内诱导产生单倍体[5]，但是草莓未受精子房离体培养诱导雌核发育的研究至今未见报道。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试材料由沈阳农业大学园艺系草莓资源圃提供。取不同基因型草莓开花前2d花药未裂开的一级或二级花蕾作外植体，并置4℃冰箱低温预处理不同时间备用免费论文网。
1.2 试验方法
试验准备：配制MS培养基（PH=5.8），低温预处理过的花蕾用自来水洗冲干净，再用70％酒精喷雾灭菌10～20S，后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡10min，无菌水冲洗3次，每次10min，在无菌条件下去除花被及雄蕊。试验中观察诱导效果，污染的子房随时弃去，并未记数。
1.2.1不同基因型比较
从草莓资源圃中取不同基因型草莓的花蕾进行比较(表1)，属于凤梨草莓(Fragaria ananassa)的有丰香、明旭、天津5号、哈尼、J10，属于弗州草莓(F.virginiana)的有弗州草莓、实生、UCl0，属于森林草莓(F. vesca)的有新疆3号、EMC。低温预处理48h，培养基为MS+2.0mg／L2,4-D+6％蔗糖十0.8％琼脂。在25℃／16℃雌核发育，每12h交替变温暗培养7d后，再采用12h，25℃光照条件与12h 16℃黑暗交替培养23d，总计培养30d后观察诱导效果。
1.2.2生长环境及发育状况不同的比较
比较春季露地苗和冬季保护地苗、一级花蕾和二级花蕾的诱导效果，低温预处理48h，培养基为MS+2.0mg／L 2,4-D+6％蔗糖+0.8％琼脂，温度与光照培养条件如1.2.1，观察诱导效果。
1.2.3低温预处理时间不同的比较
材料仍为“明旭”春季大田植株一级和二级花蕾，接种前外植体在4℃条件下低温冷藏若干时间或不冷藏，共设6个处理。培养基为MS+2.0mg／L2,4-D十6％蔗糖+0.8％琼脂，温度与光照培养条件如1.2.1，观察诱导效果。
1.2.4不同外源激素种类和浓度的比较
材料为“明旭”露地苗开花前2d的一级花蕾，在MS十6％蔗糖+0.8％琼脂培养基中比较了添加外源激素2,4-D、6-BA、NAA、KT，不同浓度、不同组合的诱导效果，温度与光照培养条件如1.2.1。
1.2.5培养基中蔗糖浓度不同的比较
材料为“明旭”露地苗开花前2d的一级花蕾，低温预处理48h，在MS十2.0 mg／L 2,4-D十0.8％琼脂培养基中比较了0，2％，4％雌核发育，6％，8％，10％六种蔗糖浓度的诱导效果，温度与光照培养条件如1.2.1。
1.2.6培养的光照和温度条件不同的比较
以“明旭”为试材，低温预处理48h，培养基为MS+2.0mg／L 2,4-D+6％蔗糖+0.8％琼脂，设置了25℃恒温连续光照、25℃恒温连续黑暗、25℃／16℃变温连续光照、25℃／16℃变温连续黑暗、25℃／16℃变温光照黑暗每12h交替5种前期(7d前)培养条件，7d后改为25℃／16℃变温、光照黑暗交替培养，光周期为12h，总计培养30d后观察统计。
2 结果与分析
2.1不同基因型对草莓未受精子房离体诱导的影响
试验表明在相同的培养条件下，不同基因型草莓未受精子房离体培养诱导效果差别很大。从表1中可见，UCl0、EMC被诱导后只产生膨大的子房和有胚的“种子”；丰香、明旭、实生、J10、天津5号不仅诱导子房的膨大，产生有胚的“种子”，而且刺激了花托基部体细胞愈伤组织的产生；而哈尼、弗州草莓诱导后只产生体细胞愈伤组织，子房不膨大，未能诱导雌核发育；新疆3号无论雌核发育还是体细胞愈伤组织均未能被诱导。诱导结种率最高的是天津5号，达72.2％，其他依次是EMC、明旭、丰香、实生、UCl0、J10，可见选择合适的基因型对成功诱导雌核发育是非常重要的。对二倍体草莓EMC诱导获得的植株染色体数观察知道其并未减半雌核发育，仍然为二倍体，综合分析似乎还可看出倍性高的比倍性低的草莓诱导产生染色体数减半的植株更容易。
表1 不同基因型对草莓未受精子房离体诱导的影响
|
基因型
Genolype
|
倍性Mult-iple
|
接种花托数
Inoculating receptacle Number
|
子房膨大花托数
Receptacle with inflated ovary
|
具愈伤组织花托数
Receptacle with callus
|
种子数
Seeds(Number)
|
结种率
(%)
Spermi-deus rate
|
|
个 Number
|
（%）
Percen-tage
|
个
Number
|
（%）
Percen-tage
|
有胚
With
embryo
|
无胚
Without
embryo
|
|
丰香Fenxiang
|
8X
|
37
|
6
|
16.2
|
12
|
32.4
|
6
|
14
|
16.2
|
|
明旭Mingxu
|
8X
|
590
|
72
|
12.2
|
251
|
42.5
|
175
|
68
|
29.7
|
|
实生Shisheng
|
8X
|
32
|
4
|
12.5
|
22
|
68.8
|
5
|
5
|
15.6
|
|
J10
|
8X
|
19
|
1
|
5.3
|
18
|
94.7
|
2
|
0
|
10.5
|
|
天津5号
TianjinNO．5
|
8X
|
18
|
4
|
22.2
|
14
|
77.8
|
13
|
1
|
72.2
|
|
哈尼Hani
|
8X
|
55
|
0
|
0
|
17
|
30.9
|
0
|
0
|
0
|
|
弗州草莓
F.virginiana
|
8X
|
145
|
0
|
0
|
69
|
47.6
|
0
|
0
|
0
|
|
UC10
|
8X
|
34
|
2
|
5.9
|
0
|
0
|
5
|
0
|
14.7
|
|
EMC
|
2X
|
10
|
2
|
20.0
|
0
|
0
|
7
|
0
|
70.0
|
|
新疆3号Xinjiang NO.3
|
2X
|
68
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
The effect ofdifferent genotype on the induction in vitro of unfertilized ovary instrawberry
table12.2 外植体的生长环境及发育状况对草莓未受精于房离体诱导的影响
从表2中可知，露地材料诱导结种率明显高于保护地材料，而且一级花蕾诱导效果又明显优于二级花蕾。
表2 外植体不同生长环境及发育状况对草莓未受精子房离体诱导的影响
Table 2 The effect of explant under thesituation of different growth environment and development status on theinduction in vitro of unfertilized ovary in strawberry．
|
外植体
Explants
|
接种的花托数
Inoculating receptaole number
|
子房膨大花托数
Receptacle with inflated ovary
|
具愈伤组织花托数
Receptacle with callus
|
种子数
Seeds(number)
|
结种率
(％）
Spermideus rate
|
|
个Number
|
(％)
Percenage
|
个
Number
|
(％)
Percentage
|
有胚
With embryo
|
无胚
Without embryo
|
|
露地苗一级花蕾
The first grade buds of outdoor plants
|
590
|
72
|
12.2
|
251
|
42.5
|
175
|
68
|
29.7
|
|
保护地一级花蕾
The first grade buds of greenhouse plants
|
90
|
8
|
8.9
|
17
|
18.9
|
11
|
5
|
12.2
|
|
露地苗二级花蕾
The second grade buds of outdoor plants
|
28
|
6
|
21.4
|
4
|
14.3
|
7
|
3
|
25.0
|
|
保地苗二级花蕾
The second grade buds of greenhouse plants
|
34
|
2
|
5.9
|
9
|
26.5
|
2
|
4
|
5.9
|
2.3 低温预处理对草莓未受精子房离体诱导的影响
接种前外植体在4℃条件下低温预处理，实验表明对诱导草莓未受精子房产生有胚“种子”的效果是非常明显的。从表3中可知，在低温处理一定时间内，诱导效果随处理时间的增长而提高，处理48h对诱导结种率最合适，时间再长则诱导结种率缓慢下降。
表3不同低温预处理时间对草莓未受精子房离体诱导的影响
Table 3 The effect of different time after cold-pretreatment on theinduction in vitro of unfertilized ovary in strawberry.
|
处理时间
Time of cold-
Pretreatment
(h)
|
接种的花托数
Inoculating receptaole number
|
子房膨大花托数
Receptacle with inflated ovary
|
具愈伤组织花托数
Receptacle with callus
|
种子数
Seeds(number)
|
结种率
(％)
Spermi-
dues rate
|
|
个
Number
|
(％)
Percentage
|
个
Number
|
(％)
Percentage
|
有胚
With embryo
|
无胚
Without embryo
|
|
0
|
51
|
3
|
5.9
|
27
|
52.9
|
3
|
10
|
5.9
|
|
12
24
|
82
64
|
11
22
|
13.4
34.4
|
64
24
|
78.1
37.5
|
16
14
|
12
13
|
19.5
21.9
|
|
48
|
590
|
72
|
12.2
|
251
|
42.5
|
175
|
68
|
29.7
|
|
60
|
73
|
17
|
23.3
|
24
|
32.9
|
18
|
14
|
24.6
|
|
72
|
31
|
8
|
25.8
|
0
|
0
|
7
|
8
|
22.6
|
2．4 外源激素对草莓未受精子房离体诱导的影响
从表4统计结果分析得知，不加外源激素不能诱导子房的膨大和雌核发育；生长素类物质2，4-D是诱导雌核发育并产生“种子”所必需的；单独添加2，4-D可诱导产生有胚的“种子”；添加细胞分裂素类物质BA和KT抑制了子房的膨大，并不同程度地促进了花托体细胞愈伤组织的形成免费论文网。
表4外源激素对草莓未受精子房离体诱导的影响
Table 4 Effects ofextrinsic hormone on the induction in vitro of unfertilized ovary in strawberry．
|
激素种类及浓度
（mg/L）
The kind and concentr-ation of hormone
|
接种的花托数
Inoculating
receptacle number
|
子房膨大花托数
Receptacle with inflated ovary
|
具愈伤组织花托数
Receptacle with callus
|
种子数
Seeds(number)
|
结种率
（%）
Spermi-deus
rate
|
|
个
Number
|
(%)
Percen-tage
|
个
Number
|
(%)
Percen-tage
|
有胚
With
enbryo
|
无胚
Without enbryo
|
|
无激素
（no hormones）
|
16
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D0.5
|
8
|
3
|
37.5
|
0
|
0
|
0
|
|
9.7
|
|
2.4-D1.0
|
41
|
3
|
7.3
|
16
|
39.0
|
4
|
|
13.6
|
|
2.4-D1.5
|
22
|
3
|
13.6
|
9
|
40.9
|
3
|
|
29.7
|
|
2.4-D2.0
|
590
|
72
|
12.2
|
251
|
42.5
|
175
|
|
12.4
|
|
2.4-D2.5
|
32
|
3
|
9.4
|
17
|
53.1
|
4
|
|
0
|
|
2.4-D1.0+BA0.5
|
20
|
0
|
0
|
14
|
70.0
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D1.0+BA0.5+
NAA1.0
|
48
|
1
|
2.1
|
45
|
93.7
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D1.0+BA0.5+
NAA1.0+KT0.5
|
83
|
0
|
0
|
65
|
78.3
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D1.0+BA0.5+NAA1.0+KT1.0
|
132
|
3
|
2.3
|
104
|
78.8
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D1.0+BA0.5+NAA1.0+KT0.5
|
76
|
0
|
0
|
33
|
43.4
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D1.5+BA1.0+NAA0.5
|
112
|
0
|
0
|
54
|
48.2
|
0
|
|
0
|
|
2.4-D1.0+
NAA1.0+KT1.0
|
164
|
3
|
1.8
|
94
|
57.3
|
0
|
|
0
|
从图1中更直接地反映出，当2,4-D浓度小于2.0mg/L时，诱导结种率随2,4-D浓度的增大而增高，2.0mg/L2,4-D的浓度在所研究的激素组合中诱导效果最好，结种率达29.7％，当2,4-D浓度为2.5mg/L时，则诱导率明显下降。
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