论文导读：实验菌种：用腐烂橙子的果皮及部分果肉加到新鲜橙汁中发酵后接种到YEPD固体培养基中培养，以酵母菌的特性及形态为基础通过镜检后筛选得到。从发酵最终得到橙子酒之间的比较来看，果酒酵母菌株发酵出的橙子酒，其酒精积累能力表现比较强。
关键词：果酒酵母，筛选
果酒富含多种维生素和氨基酸，极具保健功能，适量饮用对心血管病、衰老引起的脑机能退化以及某些癌症有益，因此具有较高的研究价值[5]。且果酒酒度低，对人体和神经没有强烈的刺激感，加之具有独特的风味和色泽，深受广大消费者的青睐[6]；作为发酵酒，果酒含有丰富的营养，适量饮用，可舒筋活络，调整新陈代谢，促进血液循环，同时具有控制体内胆固醇水平，利尿、激发肝功能和抗衰老等功效。优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类，产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌株。性能优良的菌株不仅可以为生产带来一定的经济效益，而且有时也可挽救一个因菌种性能低劣而面临亏损即将倒闭的企业，它可为它带来生命力使其重见希望。
随着人们生活水平的提高及对果酒营养价值、保健功能的认识，市场对果酒的需求必将越来越大，因此果酒是我国饮料行业的发展方向。因此，研制开发发酵型柑橘果酒，不仅可大大提高柑橘的附加值，而且将成为极受欢迎的“21 世纪的新型食品”[3]。真正优良的果酒酵母可以获得很高的发酵度，对乙醇和二氧化硫的抵抗力大， 很容易长期储存。 由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。 要获得优良的果酒酵母， 必须对其进行分离选育[7]。本实验将通过对从自然环境分离到的酿酒酵母进行诱变，以发酵能力和发酵原酒品质作为筛选指标进行筛选实验，选出高品质脐橙果酒发酵用酵母[4]。
1.实验材料与方法
1.1 材料
选取成熟完好无腐烂的橙子作为酿酒的原料。
1.1.1 菌种
实验菌种：用腐烂橙子的果皮及部分果肉加到新鲜橙汁中发酵后接种到YEPD固体培养基中培养，以酵母菌的特性及形态为基础通过镜检后筛选得到；对照菌株：安琪酵母（安琪酵母股份有限公司）。
1.1.2 培养基
YEPD培养基[4]：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，琼脂10g/L，PH值自然，121℃灭菌20min，(其中葡萄糖单独115℃灭菌30min）。
麦氏琼脂（酵母菌）培养基/醋酸钠培养基：葡萄糖1g/L，酵母浸膏2.5g/L，氯化钾1.8g/L，琼脂18g/L，醋酸钠8.2g/L，113℃灭菌30min。
1.1.3 试剂、染色剂、仪器
无菌生理盐水；吕氏碱性美蓝；草酸铵结晶紫染液；孔雀绿；95%乙醇；0.5%沙黄液；6mol/L盐酸；1g/L甲基红；200g/L氢氧化钠；0.1mol/L氢氧化钠标准溶液；10g/L酚酞指示剂；2.5g/L葡萄糖标准溶液；费林甲液[9]：硫酸铜34.65g，蒸馏水溶解并定容至500ml；
费林乙液[9]：氢氧化钠20g，酒石酸甲钠69.2g， 蒸馏水溶解并定容至200ml；次甲基蓝溶液[9]：1g次甲基蓝溶于100ml蒸馏水中；PH缓冲液：四硼酸钠溶液（PH＝9.18），邻苯二甲酸氢钾（PH＝4.00）。
滴定管；锥形瓶；烧杯；试剂瓶；移液管；容量瓶；量筒；涂布器；玻璃棒；培养皿；电炉；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；LRH―150生化培养箱（上海―恒科学仪器有限公司）；LD2X―50FB立式压力蒸汽灭菌器(江西华科精密仪器有限公司)；PHS―25酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)；酒精计（河北武强县同解仪表厂）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；Z-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）。
1.1.4 橙子汁制备
选择无霉烂、腐变果实，经去皮、破碎榨汁制得原汁。论文格式。原汁经调配后，用于果酒发酵。
1.2 实验方法
1.2.1 酿酒酵母筛选[4]
收集带酒香的腐烂柑桔水果，取腐烂的果皮及部分果肉，加入到新鲜橙汁中，20℃～25℃发酵3d，产生明显酒味后，取菌悬液，准确吸取50μL放入YEPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，28℃培养2d后进行镜检（从中挑取生长菌落，染色，以待镜检），以酵母菌的特性及形态为基础筛选得到果酒发酵用酵母。见图1：
图 1 果酒发酵用酵母
1.2.2 发酵酵母的筛选[4]
一级筛选：以在定额时间内发酵气泡产生的多少作为发酵能力强弱的指标进行筛选。
二级筛选：以糖度为15％的橙子汁进行发酵，以发酵后生成的酒香味、口感、色泽等感官指标进行筛选。
三级筛选：按照完整的橙子酒发酵工艺进行发酵，以发酵产品的理化指标和风昧等感官指标作为评判依据进行筛选。
1.2.3 橙子果酒发酵实验
发酵流程：无核橙一去皮一榨汁一调配(调整糖度)一接种酵母一发酵一贮存一过滤一橙子酒[4]
用蔗糖进行糖度调整，就筛选出来的酿酒酵母菌株与对照酵母分别进行橙子汁果酒发酵实验，在发酵速度、酒精生成、凝集性能等生物学特性方面进行比较[4]。
安琪酵母活化：室温条件下，活化25min，(接种量为2%，加水量为干酵母的10倍，配成1%的酵母活化液)[10、14]。
1.2.4 检测方法
（1）酒精度的测定：酒精计法[11]
（2）总糖的测定：费林试剂热滴定法[12]
预滴定：吸取费林氏甲、乙液各5mL和试液5mL于250mL锥形瓶中，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用2．5g／L葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示剂，继续滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。
正式滴定：吸取费林氏甲、乙液各5mL和试液5mL于250m1锥形瓶中，和比预滴定少lmL的葡萄糖标准溶液，摇匀，在电炉上加热至沸，加2滴次甲基蓝指示剂，并保持沸腾2min，在沸腾状态下于lmin内用葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。
计算公式：X＝（F-G×V）×1000/20÷100×5.00
式中：X＝总糖的含量
F＝费林甲、乙液各5ml相当于葡萄糖的克数 g
G＝葡萄糖溶液的浓度g/ml
V＝消耗葡萄糖溶液的体积ml
（3）总酸的测定：直接滴定法[13]
（4）PH值的测定：精密级数字式酸度计
先用PH缓冲液调零，再取待测样酒品测定其PH值。
（5）凝集性能：生物显微镜观察
（6）原酒评价：感官品评鉴定法[15]
感官指标主要从色泽、味感特征、香气、体态等方面鉴定。
2．结果与讨论
2.1 分离与筛选结果
自腐烂橙子中分离得到酿酒酵母菌。
2.2橙子酒中总糖的比较
试液制备时增加了蒸馏水加入量，中和以前加入了指示剂，终点易判，在费林氏液中加入适量试液，并改用葡萄糖标准溶液反滴定，再计算出酒样中总糖含量；滴定量控制良好，结果更为准确（发酵到第六天测得的总糖含量，见表1）。
预滴定正式滴定 费林氏液 葡萄糖总 糖
酵母菌体积 体积 浓度 液浓度
mlml gg/ml g/L
（实验组）
0.05 0.0025
安琪酵母19.5020.050.56
（对照组）
上表结果表明，作为对照的安琪酵母利用糖的速度快，其发酵周期短，橙子汁中的还原糖到第6d基本就消耗完；所筛选出的菌株中，发酵能力强，其发酵周期更长，发酵较为彻底。
2.3橙子酒中酒精的比较
酵母菌酒精度（%vol）
果酒酵母11
（实验组）
安琪酵母8
（对照组）
从发酵最终得到橙子酒之间的比较来看，果酒酵母菌株发酵出的橙子酒，其酒精积累能力表现比较强。论文格式。
2.4 橙子酒中总酸的比较
酵母菌酒样体积 消耗氢氧化钠标准酒样品中总酸的质量分数 X
（V0/ml） 溶液的体积（V1/ml） （以乙酸计），单位为g/L
果酒酵母20 27.58.25
（实验组）
安琪酵母20 20.056.15
（对照组）
从发酵最终得到橙子酒之间的比较来看，果酒酵母菌株发酵出的橙子酒，其酒的品质含量相对于安琪酵母发酵出的橙子酒的还要更好。
2.5 橙子酒中PH的比较
酵母菌PH值
果酒酵母3.86
（实验组）
安琪酵母3.32
（对照组）
从发酵最终得到橙子酒之间的比较来看，果酒酵母菌株发酵出的橙子酒，其PH值较大，说明其酸性较安琪酵母菌株发酵的橙子酒的酸性弱，酒的风味更平淡。
2.6 酵母凝集能力比较
酵母菌凝集性发酵泡沫
果酒酵母较好泡沫较明显，
（实验组）（成块状）相对较大
安琪酵母较差泡沫多，
（对照组）相对较少
上表结果表明，果酒酵母菌株在发酵过程中表现出了较强的活力，发酵结束后的凝集性能相对于安琪酵母菌株表现更好。
2.7 感官评价
酵母菌色泽 味感特征 香气 体态
果酒酵母 浅黄色 适口柔和 橙子果香 澄清
（实验组）
安琪酵母 暗黄色 刺激感较强 橙子果香 有浮膜
（对照组）较刺激
从发酵最终得到橙子酒之间的比较来看，果酒酵母菌株发酵出的橙子酒，在感官上易于被接受，具有橙子特有的风味，可以作为发酵橙子酒用菌株。
2.8 菌株鉴定
酵母菌子囊孢子的观察：将活化的酿酒酵母移接至醋酸钠培养基上，置30℃恒温培养3-5天；挑取少许产孢子菌苔于载玻片的水滴上，经涂片，热固定后，加数滴孔雀绿1min后水洗，加95%乙醇30s，水洗，最后用0.5%沙黄液复染30s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干，制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色，子囊孢子的形状为椭圆形。菌株个体形态呈长圆形，以出芽繁殖为主；在产香培养基上，菌落为圆形，白色，表面中心微凸，较厚，有淡淡的醇香味产生[7]。论文格式。
根据以上个体形态、培养特征及观察鉴定。结果显示：自腐烂橙子中分离得到的酵母菌都属于酵母菌属（Saccharomycescerevisiae）[16]。
3. 结论
从腐烂橙子上分离得到的酿酒酵母菌株的发酵实验来看，所得菌株都可以作为橙子果酒发酵用，在菌株活性、发酵强度、凝集能力、发酵时间等发酵性能及最终制得橙子酒的成品色泽、风味口感等品质方面，总体表现都很好，适宜作为橙子酒发酵生产用菌种或橙子酒发酵专用菌种选育的出发菌株。橙子果酒的开发不仅符合国家由粮食酒向水果酒转变的发展方向，同时也为橙子的深开发开辟了一条新路，具有十分广阔的市场前景。
【参考文献】
[1] 孙海翔.果酒生产中优良酵母菌株的选育及新工艺新技术的应用[D]. 山东轻工业学院，2002.
[2] 张卫国，陈掌权.柑桔果酒2种发酵方法的比较研究[J].中国酿造,2006(7)：55-58.
[3] 陈瑶，赖崇德，刘玄，倪国荣.橙汁酿酒酵母菌株的分离筛选和发酵性能的测定[N].江西：农业大学学报，2007，29(4).
[4] 游见明.桔子果酒酵母的分离筛选[R].中国酿造，2009(4) .
[5] 何义，马雯，马晓燕，林杨，张伟，李英军.果酒研究进展[C].酿酒科技，2006(4).
[6] 何义.鸭梨果酒酿造专用产香酵母菌分离鉴定及香气成分分析[D].河北农业大学，2006.
[7] 张翠英.优良果酒酵母的分离选育及发酵性能研究[D].扬州大学，2006.
[8] 安冬梅，张艳萍.果酒加工工艺的研究进展[C].安徽农业科学，2007，35(19):5859-5860，5911.
[9] 董林青，牛国文，刘志毅，迟菁.应用不同方法测定发酵液中的糖含量[J].广东化工，2009，36(9).
[10] 王岚，夏兵兵，张学峰，吴建国.桔子果酒酿造工艺研究[J]. 中国酿造，2008，(11).
|
