| 1.5转化植株的Southern杂交分析
为了确认CjFRO2基因已经整合入转化枳基因组中及其在基因组中的拷贝数，对PCR检测为阳性的拟转化枳进行Southern杂交分析。取拟转化枳的叶片组织提取基因组DNA，用限制性内切酶ClaI 30℃酶切6 h（每微克DNA加入5U内切酶），在0.8%的琼脂糖凝胶上电流分离，每孔上样25 ug，在TAE缓冲液中以1 V/cm的电压电泳16 h。经HCl脱嘌呤、NaOH中和及Tris-HCl平衡后用高盐（20×SSC）法将DNA转移到尼龙膜上，尼龙膜用紫外交联仪固定。用Roche地高辛探针标记试剂盒（DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I (for color detection with NBT/BCIP)）进行Southern杂交，具体操作方法见试剂盒说明书。因为枳基因组中存在内源三价铁螯合物还原酶基因，故采用CjFRO2基因表达单元的CaMV 35S启动子序列作为探针模板。探针引物为35SL：5’- GGT AGT TCC CAC TGA ATC AA-3'；35SR：5’- GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3'，探针模板长500 bp。
1.6转化植株的Real-Time PCR分析
取转CjFRO2基因枳根尖细嫩组织，用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取根尖部分总RNA，将RNA浓度稀释为500 ng/μL。用PrimeScriptTM RTreagents Kit （TakaraCode:DRR037S）试剂盒合成cDNA。SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行Real-Time PCR反应。反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，PCR上游引物（10μM）0.5μL ，PCR下游引物（10μM）0.5μL ，反转录产物1 μL，ddH2O（灭菌双蒸水）10.5μL。反应条件为：95℃预变性90s；95℃，30s，57℃，20s，72℃，20s，40个循环；72℃，60s。PCR反应在美国BIO-RAD iQ5 实时PCR检测系统上进行。用actin基因作内标生物论文，actin上游引物：5’- CAT CCC TCA GCA CCT TCC -3’；下游引物：5’- CCA ACC TT A GCA CTT CTC C -3’，产物长198 bp。CjFRO2基因上游引物：5’ - TCA AAT CCA TCA GACTCA CCG -3’，下游引物：5’- AGA AAC GAG TGA CAA TGC CC -3’， 产物长198 bp。每个样品做3个重复，以10倍梯度稀释的转基因枳根总cDNA分别建立actin和CjFRO2基因的标准曲线。Real-Time PCR反应完成后并分析产物的融解曲线，凝胶电泳确认扩增产物特异性论文格式模板。采用Delta Delta Ct法分析实验数据，确定CjFRO2基因的相对表达量。
2.结果与分析
2.1拟转化枳的PCR鉴定
对生根培养的拟转化苗用CjFRO2基因表达单元的特异引物进行PCR检测，结果显示，阳性拟转化苗的PCR扩增片段与质粒扩增片段一致，都在750 bp左右的区域有一条特异性的条带，而阴性对照和水中未能扩增出相应的特异条带(图2)，初步判断CjFRO2基因已整合到枳的基因组中。将阳性拟转化苗种植于隔离温室中，培育成植株。
1 2 3 45 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16
 
图2 部分转CjFRO2基因枳的PCR检测结果
Fig 2 PCR detection of putative transformed plants of Poncirustrifoliate
1~12: 拟转化枳; 13: DL2000; 14: pBIcjFRO2;15:非转化枳对照; 16: 水对照
1~5: putative transformed Poncirus trifoliate; 6:pBIcjFRO2; 7: Poncirus trifoliate; 8: water; M: DL2000
2.2拟转化枳的Southern杂交分析
为确认CjFRO2基因已经整合入转化枳基因组中及其拷贝数，随机抽取8株PCR阳性拟转化枳，分别命名为PT1~PT8，对其进行Southern杂交分析。Southern杂交结果显示(图3)，非转基因枳对照没有杂交信号，而部分拟转化枳中有特异杂交信号，杂交条带大小都大于4.6 kb，与预测的杂交信号位置一致。其中PT2、PT3、PT5和PT8只有一个杂交条带，推测CjFRO2基因以单拷贝形式整合入其基因组中；PT1和PT6有2个杂交条带，推测CjFRO2基因以双拷贝形式整合入其基因组中；而PT4和PT7中未发现杂交条带，推测其为PCR假阳性生物论文，CjFRO2基因未整合入其基因组中。
M 1 23 4 5 6 7 8 9
 
图3 部分转CjFRO2基因枳的Southern杂交分析
Fig 3 Southern blot of putative transformed plants of Poncirustrifoliate
M: λ DNA/Eco130I(StyI); 1: 非转化枳对照;; 2~9: 拟转化枳
M: λ DNA/Eco130I(StyI); 1: Poncirustrifoliate; 3~10: putativetransformed Poncirus trifoliate;
2.3转CjFRO2基因枳的表达分析
为避免多拷贝引起的转基因沉默及基因表达水平下降，本实验中仅选取单拷贝的转基因枳PT2、PT3、PT5和PT8，对CjFRO2基因的表达情况进行Real-Time PCR分析[28], [29],[30]。通过Delta Delta Ct法对转基因枳中CjFRO2基因相对表达量分析表明，CjFRO2基因在4个转基因枳中都能有效表达，而非转基因枳对照中则无表达（图4）。与表达量相对较低的PT8相比，PT2、PT3和PT5表达量相对较高，分别为PT8的3.2倍、2.4倍和2.5倍。
图4 转基因枳PTF2、PT3、PT5和PT8根尖CjFRO2基因表达的Real-time PCR分析
Fig4Real-Time PCR analysis of the expression of CjFRO2 in PT2, PT3, PT5 and PT8
2.4CjFRO2基因表达稳定性分析
取表达量相对较高的PT2株系，取其PT2-T0成熟枝条，扦插生根，获得PT2-T1代。取T1代植株成熟枝条，扦插生根，获得PT2-T2代。利用Real-Time PCR的方法检测转CjFRO2基因枳无性繁殖3代植株中CjFRO2基因的表达情况（图5）。与PT2-T0植株的表达量相比，PT2-T1和PT2-T2代CjFRO2基因的相对表达量变化不大，分别为T0代的1.05倍和0.9倍。可见CjFRO2基因在转基因枳无性繁殖后代植株表达差异不大，表达相对稳定。
图5 转基因枳PT2株系无性繁殖后代CjFRO2基因Real-time PCR分析结果
Fig4 Real-Time PCR analysis of the expression of PT2 and its clonal descendents
3.讨论
缺铁黄化严重影响柑橘果实的商品性能及经济价值，目前全国30%的柑橘种植区存在不同程度的缺铁黄化现象，严重阻碍了我国柑橘产业的可持续发展。传统防治柑橘缺铁的方法主要集中在喷施叶面肥、树干注射、改良土壤、靠接耐缺铁砧木等常规栽培方法上，这些方法需要花费大量的人力、物力，且很难达到理想的效果，无法从根本上解决柑橘缺铁黄化的问题[31]。培育并推广耐缺铁优良新品种是最根本和最有效的解决柑橘缺铁黄化的有效方法。柑橘是多年生木本植物，常规育种途径培育耐缺铁柑橘新品种难度很大，国内外迄今尚未见柑橘耐缺铁育种成功的报道。植物基因工程的迅速发展为柑橘品种改良开辟了一条新途径，为柑橘耐缺铁育种提供了一个有效的方法[32]。
三价铁螯合物还原酶基因的高效表达是植物耐铁胁迫的重要因素论文格式模板。早期在拟南芥中研究发现生物论文，三价铁螯合物还原酶基因是转录后调控，在正常供铁情况下，转35S-FRO2拟南芥株系FRO2基因在mRNA水平上积累，但根系表面三价铁螯合物还原酶活性并未增加；在铁胁迫下，转入35S-FRO2的株系的根系三价铁螯合还原酶的活性增强幅度较野生型更大，植株的生长情况更好，说明在拟南芥中组成型表达三价铁螯合还原酶基因能提高其耐铁胁迫能力10。但后来的研究证明，三价铁螯合物还原酶基因并非在转录后水平调节，而是在转录水平上受FIT、AtbHLH38、AtbHLH38等转录因子在转录水平上调节，在拟南芥中组成型表达FIT/AtbHLH38或FIT/AtbHLH38转录因子的实验发现，在正常供铁和缺铁胁迫两种情况下，转基因植株FRO2基因都能有效表达，在其根系中都能检测到较强的还原酶活性[33], [34]。在番茄中组成型表达FRO2基因表明，与对照相比，在正常供铁情况下，转基因番茄根系FRO2基因表达量增加，铁螯合物还原酶活性增强了1.75倍，叶片中有效铁的含量增加了1倍；在铁胁迫情况下，转基因植株根系酶活性增强了1倍，叶片中有效铁的增加了0.5倍14。在八楞海棠中组成型表达FRO2基因也发现在正常供铁情况下，转基因植株根系铁螯合物还原酶活性是对照的1.875倍，在缺铁胁迫下为2.182倍[35]。以上的结果表明，在植物中组成型表达三价铁螯合物还原酶基因可以有效地增强其根系三价铁螯合物还原酶的活性生物论文，提高转基因植株中铁吸收能力。本研究将35S启动子控制下的在铁胁迫下高效表达的资阳香橙三价铁螯合物还原酶基因CjFRO2转入枳中，Real-Time PCR分析表明，4个单拷贝的转基因株系中CjFRO2基因都能组成型表达，为提高转基因枳吸收铁的能力奠定了基础。
外源基因能否在转基因植株中稳定遗传与表达是影响转基因植物应用前景的重要因素。枳通过珠心胚无性性繁殖，无性繁殖后代有较强遗传稳定性，外源基因在代间表达一致性更好。对菊花、马铃薯和白杨等的无性繁殖后代的遗传稳定性研究表明，外源基因的表达保持很强的稳定性和可预测性[36], [37],[38], [39]。本研究中CjFRO2基因在三代转基因枳中的表达也非常稳定，说明转入CjFRO2基因能在枳中稳定遗传与表达。
4.结论
三价铁螯合物还原酶是碱性土地区植物铁吸收的关键酶，能将难以被植物吸收的Fe3+还原为易被植物根系吸收的Fe2+。利用在铁胁迫中高效表达的香橙CjFRO2基因在枳基因组中的组成型表达，提高转基因枳的铁吸收能力，为进一步培育耐缺铁优良枳砧木，改良枳砧柑橘在碱性土壤地区因缺铁而引起的黄化、低产的问题，增强枳砧柑橘栽培的适应性，扩大枳砧柑橘种植面积开辟了一条新途径。同时为提高转CjFRO2基因枳砧柑橘果实品质，增加果实中铁的含量，满足人们对铁的需求作出尝试。
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