论文导读:：枳砧有很多显著的优点。杂交分析。在转基因枳中的整合与表达。
论文关键词：香橙三价铁螯合物还原酶基因，枳，Southern杂交分析，Real-TimePCR表达分析
铁是植物生长必需的营养元素，在植物的光合作用和呼吸作用中起着重要作用。铁与叶绿体片层结构形成有关，缺铁时，叶绿体的片层结构减少，叶绿素合成受阻，叶片失绿黄化。尽管土壤中铁的含量非常丰富，但几乎都是以难溶于水的Fe3+形式存在，不易被植物吸收利用。为了获得充足的铁，双子叶植物通过一个“机理Ⅰ”的铁吸收系统吸收难溶的Fe3+：(1)分泌质子和有机酸酸化根表周围，溶解更多的Fe3+ ，(2) 合成三价铁螯合物还原酶（Ferric-chelatorreductase生物论文，FCR），将溶解的Fe3+还原成Fe2+的 (3)利用高亲和性的Fe2+转运系统将Fe2+转运到根表细胞内。同时还伴随根尖膨大、根毛增多、根表产生转移细胞等生理生化现象来增强吸收土壤中难溶的三价铁[1], [2],[3]。
三价铁螯合物还原酶的还原过程是植物铁吸收中非常关键的一步，是植物铁吸收过程中的限速步骤[4]。从拟南芥、番茄、苹果和柑桔等作物的研究表明，三价铁螯合物还原酶基因的表达对提高作物的耐铁胁迫能力相关性很大，组成型表达三价铁螯合物还原酶基因的植株较野生型植株在低铁条件下生长得更好[5]。目前已经有多个植物三价铁螯合物还原酶基因被克隆出来[6], [7], [8], [9], [10]，为植物耐缺铁改良提供了良好的基础。研究发现，在缺铁胁迫下，转入高效的外源三价铁螯合物还原酶基因材料的三价铁螯合物还原酶活性、叶片中有效铁的含量和叶绿素含量较非转基因材料明显提高，叶片黄化程度较对照材料更轻或未黄化，植株对缺铁的耐受能力更强；且在正常供铁情况下，转基因材料的叶片中有效铁的含量和叶绿素含量较非转基因材料也明显提高[11], [12],[13], [14],[15],[16]。因此，利用三价铁螯合物还原酶基因提高植物的铁吸收能力，为不耐缺铁植物的改良提供了一条有效的途径论文格式模板。
果树是受铁胁迫影响最为严重的作物之一，大多数种植的果树树种都有缺铁黄化的报道[17]。果树为多年生植物，种植在固定的地点上，比一年生的植物更容易受铁胁迫影响。研究发现果树种属间耐缺铁的能力差异很大，在铁胁迫时，耐缺铁品种根系三价铁螯合物还原酶活性明显强于不耐缺铁品种23, [18],[19]。枳(Poncirus trifoliate (L.) Raf.)是目前国内应用最多、最广的柑橘砧木。枳砧有很多显著的优点，但枳不耐缺铁，碱性土地区枳砧柑橘会发生缺铁黄化，造成减产甚至无产。香橙是表现最好的柑橘耐碱砧木之一，能耐受pH7.5以上的碱性土壤[20], [21]。香橙在缺铁胁迫下，三价铁螯合物还原酶活性在胁迫4周时即达到最强生物论文，增强约20倍；而在田间表现极易缺铁的枳在铁胁迫4周时，三价铁螯合物还原酶活性仅增加约3倍，叶片叶绿素含量显著低于香橙[22], [23]。2004年以来，本室与西南大学生物技术中心合作，从耐缺铁柑橘砧木——资阳香橙(Citrusjunos Sieb. ex Tanaka)中克隆了与耐缺铁性状相关的三价铁螯合物还原酶基因（CjFRO2，DQ985810.1），并利用该基因开展柑橘耐缺铁基因工程育种工作。本研究利用包含CaMV 35S-CjFRO2组成型表达单元的表达载体pBIcjFRO2，采用根癌农杆菌介导法将CjFRO2基因导入枳中。通过PCR验证，Southern杂交分析，Real-Time表达分析，筛选目的基因已经整合入枳基因组中且表达正常的转基因枳株系，为培育耐缺铁优良柑橘砧木新品种奠定基础，同时为创造铁高效和富含铁营养农作物新品种提供科学依据和应用实例。
1.材料与方法
1.1实验材料
从成熟枳果实中取出种子，在超净工作台上用含有0.1% Tween 20的次氯酸钠溶液消毒10分钟，然后用灭菌水冲洗3遍，剥去种皮，接种在MS固体培养基上，28℃暗培养20天左右，取生长旺盛的枳上胚轴作转化受体用。
1.2表达载体和转化菌株
表达载体pBIcjFRO2(图1，由西南大学生物技术中心裴炎教授提供)。以植物常用表达载体pBI121为基础，切去gusA基因序列，引入CjFRO2基因的完整cDNA序列，构建一个以新霉素磷酸转移酶（NPTII）为筛选标记、包含CaMV 35S-CjFRO2组成型表达单元的表达载体[24]。用电击法将该表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404中生物论文，挑取阳性单克隆，用含硫酸链霉素125 ug/ml和卡那霉素50 ug/ml的LB液体培养培养过夜。在过夜培养的菌液中加入终浓度为15%的甘油，-70℃冷冻保存。转化前取-70℃冷冻保存的菌株，在含硫酸链霉素125 ug/ml和卡那霉素50 ug/ml的LB固体培养培养上划线培养，28℃暗培养36 h后挑取单克隆，用含相同抗生素的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体，用含有100 uM乙酰丁香酮的MS液体培养基重新悬浮，待农杆菌浓度达到5×108 CFU/ml时用于枳壳上胚轴转化。
图1 表达载体pBIcjFRO2质粒结构图
Fig 1 Map of plasmid pBIcjFRO2
1.3转化方法
无菌条件下将生长良好的枳上胚轴切成长约1 cm左右的小段，在农杆菌悬浮液中侵染15min , 取出用无菌滤纸吸干残余菌液，在含有100 uM乙酰丁香酮的MS培养基中26℃暗培养3d 后, 转移到含100 ug/ml卡那霉素的MS筛选培养基（MS + BA 6mg/l + 0.1 mg/lNAA）中进行光照培养，培养基中同时加入500 mg/l羧苄青霉素抑制农杆菌的生长。培养温度为26℃，光照度2000 Lx(16h/d)。 15天后将外植体转入含0.5 mg/l NAA的MS筛选培养其中继续培养[25]。待不定芽茎长于1cm后，将不定芽切下诱导生根[26]论文格式模板。
1.4转化苗的PCR检测
切取经生根培养的拟转化芽叶片约20 mg（约1 cm2），用DNA微量提取法提取DNA[27]。由于枳基因组中存在内源三价铁螯合物还原酶基因，故根据CaMV 35S-CjFRO2基因表达单元结构设计特异PCR检测引物，上游引物位于CaMV 35S启动子序列，下游引物位于CjFRO2基因序列，引物序列为：FRO2-1：5’- TTC GCA AGA CCC TTC CTC TA -3'；FRO2-2：5’- TTC GCT CCA TTC TAG CAC CT -3'，扩增片段长度为768 bp。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测， pBIcjFRO2质粒作阳性对照，非转化枳作阴性对照，水作空白对照。将PCR检测为阳性的转化苗经练苗后移载于温室中生物论文，培育成植株。
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