山葡萄转色期果皮cDNA文库构建和分析-论文网

随机挑取16个单菌落，进行菌落PCR扩增鉴定，估计文库的重组率和插入片段大小。电泳结果（图4）显示，插入片段范围在0.5～2kb，平均长度约0.80kb，没有空载体，重组率接近100%，表明所构建的cDNA文库质量较高。

图4山葡萄cDNA文库插入片段的PCR检测

1-16:cDNA插入片段；M:DL2000分子量

Fig.4PCRdetectionofinsertssizefromV.amurensiscDNAlibraryonagarosegel

1-16:cDNAinsertfragment;M:DL2000Marker

2.5EST序列分析及功能分析

山葡萄转色期果皮cDNA文库测序获得1009条EST序列，其中无空载体序列，有35条插入片段小于100bp的低质量序列，占总测序克隆数的3.47%。去除低质量的序列后，最终获得了974条高质量的ESTs序列，占全部测序量的96.53%。对其进行GenBank提交，GenBank接受号码为：GW666520～GW667493，这974条ESTs有效序列长度跨度从100bp～595bp，平均长度为403.15bp。利用phrap软件进行序列拼接，共获得710个unigenes。其中包括97个重叠群（Contigs），613个单拷贝EST（Singlets），非冗余序列占全部序列的72.90%。

经过BlastX分析，所有ESTs中未知功能蛋白和比对后没有显著匹配序列分别占33.47%和25.87%。通过单一EST序列与NCBI的BlastP比对，并进行COGs分类（表2），基因序列总数共163个，其中属于代谢基因序列62个，占基因总数38.04%；属于信息储存和加工基因序列40个，占基因总数24.54%；属于细胞加工基因序列37个，占基因总数22.70%；属于未知不明确基因序列24个，占基因总数14.72%。

表2山葡萄转色期果皮cDNA文库ESTs的COG分类结果

Fig2COGclassificationofveraisonpericarpfromV.amurensis

制备高质量的RNA是构建一个成功cDNA文库的重要前提。在山葡萄果皮总RNA提取过程中，要时刻注意RNA酶的污染。由于山葡萄果实中富含多糖、多酚等次生代谢产物，而且多糖类物质与RNA具有相似的结构，因为在提取过程中会与RNA形成胶状物而共沉淀，降低RNA产量和纯度。果实中的多酚物质在提取过程中易发生氧化，形成醌类，从而与RNA形成不可逆结合，导致RNA活性丧失并在后续酚仿抽提过程中丢失。本实验采用的改良CTAB法针对试材多糖、多酚含量高的特性，加入低浓度的乙醇和高浓度的醋酸钾有效去除了多糖。CTAB提取液中加入了β-巯基乙醇，β-巯基乙醇既可以用来抑制RNA酶的活性，还可以作为强还原剂防止多酚氧化，打断多酚氧化酶的二硫键使之失活，从而成功提取出纯度和完整性均符合要求的山葡萄果皮总RNA。

文库的完整性和覆盖度是构建cDNA文库的关键，但同时还需注意组织的特异性和文库内基因的代表性。本文采用Clontech公司的CreatorSMARTcDNA文库构建试剂盒和SMART技术构建山葡萄转色期果皮cDNA文库。在提取高质量的总RNA的前提下，不经过mRNA的纯化过程，避免了分离纯化mRNA会丢失片段的情况，直接用总RNA建库，mRNA最大限度地转化为cDNA，从而有效地保证cDNA的完整性。采用SMART技术建库，不需要甲基化、接头平端等烦琐操作。LD-PCR合成cDNA第二链时，PCR扩增循环数的确定对于cDNA文库质量有很大影响，循环数太少则产量低，循环数过多可能会增加短片段高拷贝基因的比率，因为PCR扩增时短片段cDNA会优先扩增。根据所用总RNA的质量，本研究用24个循环LD-PCR合成第二链cDNA，从PCR产物电泳结果来看，效果理想。cDNA文库构建过程中的分级分离操作非常重要，要去除部分小于500bp的cDNA片段，防止插入片段的平均长度过短，否则文库的应用价值降低。但过多的筛除cDNA片段，势必造成原始文库的滴度降低，影响文库的质量。本文合并了7～10管的cDNA样品，收到良好的效果。

文库的滴度、重组率及插入片段的大小是鉴定cDNA文库质量的指标。一般文库的滴度能达到10pfu·mL以上为有效的文库。本文所获得的山葡萄果皮转色期cDNA文库的原始滴度为1.12×10pfu·mL，扩增后的文库滴度为2.82×10pfu·mL，插入片段平均长度为0.80kb，没有空载体，重组率接近100%。这些数据都表明此文库能够满足构建完整文库和下一步实验的要求。

cDNA文库作为研究生物体功能基因组的主要手段,在基因筛选、分离和克隆中具有重要作用。

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