| 将转化细胞用LB液体培养基补足1mL，37℃振荡培养1h。取50μL稀释物涂布于37℃预热的90mm含30μg﹒μL氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养。次日检查平板菌落生长状况，将达到要求的连接转化混合物汇聚到一起获得未扩增的原始文库。
表1cDNA与载体连接反应的体系
Table1ComponentsofreactionofligationcDNAintovector
µL
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cDNA
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0.1μg·μL pDNR-LIB
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10× 连接缓冲液*
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10 mmol·L ATP
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T4 DNA连接酶
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去离子水
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连接反应A
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0.5
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1.0
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0.5
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0.5
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0.5
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2.0
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连接反应B
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1.0
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1.0
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0.5
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0.5
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0.5
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1.5
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连接反应C
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1.5
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1.0
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0.5
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0.5
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0.5
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1.0
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*连接缓冲液组分：500mol·LTris-HCl(pH7.8)、100mol·LMgCl、100mol·LDTT、0.5mg·mL牛血清白蛋白
1.5文库质量鉴定
随机挑取16个单菌落，使用M13引物进行菌液PCR鉴定。反应参数为：94℃30s；94℃30s，68℃2min，进行25个循环反应；72℃6min。反应结束后，取5μLPCR产物进行1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，确定文库重组率和插入片段大小。原始文库不稳定，可按照试剂盒上的说明书测定原始文库的滴度，文库的滴度以每毫升含噬菌斑形成单位（plagueformingunit，pfu）的数目计算。根据滴度在LB琼脂板上扩增文库，文库扩增后加25%的甘油置于-80℃下保存。
1.6EST序列和功能分析
本实验对1009个随机挑取的单菌落进行3′端测序。测序引物为T7。测序由北京华大基因公司完成。用Phred程序读取测序峰图文件，将获得的测序结果用Cross-Match软件结合手动操作去除载体序列及低质量序列。处理后的序列向GenBank的dbEST提交，用phrap程序对EST进行contig拼接，从而获得较完整的一致性ESTs序列。对于得到的非冗长ESTs序列，使用BlastX将其和GenBank提供所提供的非冗余蛋白数据库（Non-redundantdatabase,NR）进行同源性比较，从而获得部分ESTs功能的确定和提示，然后依据NCBI提供的蛋白直系同源数据库（Clustersoforthologousgroupsofproteins,COGs）的标准对他们进行分类。
2实验结果
2.1总RNA的提取
提取山葡萄转色期果皮总RNA，经核酸测定仪测定其紫外吸收值，OD为1.94，表明获得的RNA纯度较高，经1.1%的琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，28SrRNA和18SrRNA条带清晰，亮度比接近2﹕1，RNA没有降解，比较完整，其纯度和完整性均符合建立cDNA文库的要求。
图1总RNA的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1agarosegelelectrophoresisoftotalRNA
2.2dscDNA的合成
反转录后第一链cDNA经过LD-PCR合成dscDNA。经1.1%琼脂糖凝胶电泳检测，dscDNA片段的长度大多集中500bp以上（图2）。进一步表明RNA质量合格，降解量少，dscDNA的长片段较多，已经符合建库要求。
图2山葡萄dscDNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
1：双链cDNA；M：DL2000分子量
Fig.2AgarosegelelectrophoresisofdscDNAfromV.amurensis
1:dscDNA;M:DL2000Marker
2.3山葡萄的cDNA分级分离
dscDNA经过蛋白酶K消化和SfiI酶切后，再经过CHROMASPIN-400柱分级分离。收集片段大小不同等级的cDNA片段，共收集16个离心管，每管一滴。分离结束后，每管取3μL进行1.1%琼脂糖凝胶电泳，电泳10min左右。电泳结果（图3）表明，1～6管几乎没有cDNA片段；从第7管开始出现cDNA弥散片段，并且cDNA的片段逐渐变小；7～10管中的cDNA长片段多，长度分布范围基本大于500bp；从11管以后开始有明显小于500bp的片段，舍去11管以后的cDNA片段，避免过多的小片段与载体优先连接。因此合并7～10管的cDNA用于连接。
图3山葡萄dscDNA过柱分级分离电泳图谱
1-16:过柱后的dscDNA；M:DL2000分子量
Fig.3AgarosegelelectrophoresisofV.amurensisdscDNAafterfractionation
1-16:dscDNAseparatedbyCHROMASPIN-400;M:DL2000Marker
2.4cDNA文库质量鉴定
初始文库可间接反应文库的大小，文库的大小以库容量来表示。库容量是衡量文库代表性的量化指标之一，它反映的是该文库能包含多少来源细胞中表达的信息，以当时来源细胞中mRNA种类的重组cDNA分子数来表示。经检测，在3个cDNA与pDNR-LIB载体连接反应中，连接反应C效果最好，cDNA与载体比例为1.5:1。山葡萄果皮转色期初始文库滴度为1.12×10pfu·mL。 2/4 首页 上一页 1 2 3 4 下一页 尾页 |
