| 以中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP 基因推导的氨基酸序列为检索序列，通过NCBI的BLASTx程序检测与其同源的氨基酸序列，结果发现：杨毛果，大豆，玉米中有相似序列，同源性在62%-59%之间。中国野生葡萄VpUSP基因编码的氨基酸序列与Arabidopsis thaliana（NP_196972）﹑Arabidopsis thaliana（NP_566140）﹑Brassica rapa（ABV89649）等基因编码的USP蛋白的氨基酸序列同源性分别为133/175(76%)﹑126/175 (72%)﹑128/175(73%)；同时，利用DNAStar软件，将推导的中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP氨基酸序列与检索到的其它植物的USP氨基酸序列进行聚类分析，结果如图。由聚类分析图可看出，中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP 氨基酸序列与拟南芥USP能聚类在一起，说明两者在进化过程中关系较近；而与其它植物相应的USP进化距离较远。
图4 VpUSP与其他USP基因的系统进化树分析
Fig4 Phylogenetic tree of VpUSP and other USP gens
2.4中国野生华东葡萄VpUSP基因诱导表达分析
利用RT-PCR方法，对中国野生华东葡萄抗病与感病株系接种白粉菌后广泛逆境蛋白的表达变化情况进行了分析。结果表明，在抗感株系未接种白粉菌的叶片中，均能检测到USP基因的少量表达。
VpUSP基因在抗病华东葡萄株系白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1中的表达受白粉病的诱导，在侵染白粉病48h后表达量达到高峰，随后逐渐降低。（图5）
与之相比，VpUSP基因的在感病的中国野生华东葡萄株系白河-35-2，“6-12-2”，广西-2中并无明显变化(图6)。以上结果表明，VpUSP基因的转录在抗病葡萄株系白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1中受白粉病的诱导生物论文，对白粉病处理的响应时间在48h时达到高峰，说明VpUSP可能参与了抗病华东葡萄株系抗白粉病的过程。
 A
 B
 C
图 5 RT-PCR分析中国野生华东葡萄抗病株系对白粉菌诱导的表达分析
A-C 白河-35-1；白河-13-1； 6-12-6
Fig 5 RT-PCRanalysis of the expression of VpUSP in resistant Vitis pseudoreticulatain response to Uncinula necator Schw. Burr.
GAPDH is Actin；A-CBAIHE-35-1； BAIHE-13-1； 6-12-6
 A
 B
 C
图 6 RT-PCR分析中国野生华东葡萄感病株系对白粉菌诱导的表达分析
A-C：白河-35-2；广西-2；6-12-2；
Fig 6 RT-PCRanalysis of the expression of VpUSP in suspectible Vitis pseudoreticulatain response to Uncinula necator Schw. Burr.
GAPDH is Actin；A-C： Baihe-35-2；Guangxi-2；6-12-2
3. 讨论
本研究在本课题组前期构建的白粉菌诱导下的中国野生华东葡萄白河-35-1cDNA文库中筛选获得的一条与广泛逆境蛋白相关的EST序列。结合RACE技术，获得了该基因的全长序列。通过NCBI网站的核酸、蛋白比对及进化分析及其他植物USP相关基因的报道中推测，我们克隆到的中国野生华东葡萄白河-35-1 USP基因属于USP基因家族成员。
USP蛋白在古生菌，细菌，植物中均被发现，但在于动物中尚未见报道［7］。USPA蛋白在埃希氏菌属大肠杆菌细胞生长受到限制［10］，DNA被损坏时诱导表达［11］；该蛋白在化学毒素，渗透胁迫，UV照射条件下调节细胞中的营养物质［4，5，6］；被认为外界压力的生物传感器［12］论文提纲怎么写。在埃希氏菌属大肠杆菌细胞中发现，USPA与细胞分裂蛋白有协同作用，同时可激活RecA的表达，RecA蛋白是细菌中参与DNA同源重组修复的重要蛋白，增强细胞抗性［13］。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物参与DNA同源重组修复的重要蛋白［14］。我们所克隆到的VpUSP基因在中国野生华东葡萄抗性种质中均能被葡萄白粉病菌所诱导，至于其是否通过激活Rad51的表达增强细胞抗性还需要进一步研究。
近年来,对USP基因的研究主要集中在干旱，水分等非生物胁迫诱导方面。在多种植物中研究表明，在植物受到胁迫时，USP相关基因表达量会明显上调，可增强植物的抗逆性。GUSP1和GUSP2在水分胁迫下木本棉中诱导表达［15］，HSPCB基因在高水分胁迫情况下有益于棉花的生长［16］，ER6基因在番茄成熟过程中被诱导，在果实形成不同时期，表达量随着时间的变化而不同，在果实变为红色时，表达量达到高峰［17］；OsUsp1基因在深水性水稻受到高水分胁迫1h后被强烈诱导表达，并且视为分子调节基因［7］。
对于USP基因在植物生物胁迫方面的研究尚无相关报道。我们结合cDNA文库及RACE技术，在中国野生华东葡萄高抗白粉病株系白河-35-1中，筛选得到一条与胁迫相关的USP基因生物论文，利用半定量PCR技术对其在葡萄抗白粉病过程中的表达方式进行研究。
我们选择了中国野生华东葡萄中3个抗病株系和3个感病株系分别进行该基因的表达研究，结果发现VpUSP基因在未受生物胁迫的6个株系中均有表达，抗病株系表达量极其微弱，但在感病株系表达方式非常独特，其表达水平始终比较强，前人研究结果表明，USP基因是一种诱导型基因，因此在感病株系中的独特表达方式还有待进一步研究。
在抗病株系中，接种白粉病菌后VpUSP基因表达量随着接种时间的延长而增强，在48h达到表达峰值，而后下降。这就表明VpUSP基因在抗病株系中属诱导性表达基因，其参与了中国野生华东葡萄的抗病诱导。在抗病葡萄中，这种表达方式与非生物胁迫在诱导条件下的表达是相符的。但在感病株系中，接种白粉病菌后，表达量变化不明显，表明VpUSP基因属组成型表达基因，不参与抗病诱导。这与前人对于非生物胁迫的研究结果截然相反。
4.结论
利用RACE, RT-PCR方法，首次分离出一个受病原菌诱导的中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP基因的全长cDNA序列。VpUSP基因转录表达水平在白粉病菌侵染华东葡萄抗病株系48h后表达达到高峰，初步表明中国野生华东葡萄VpUSP基因在与白粉病菌互作过程中具有表达活性。
参考文献
[1]HE Pu-chao，WANG Yue-jin，WANG Guo-ying， REN Zhi-bang，HE Chun-cheng. The studies on the disease-resistance of Vitis wild species originated in China[J]. Scientia Agricultura Sinica，1991，24（3）: 50-56.贺普超,王跃进,王国英,任治邦,和纯成. 中国葡萄属野生种抗病性研究[J]. 中国农业科学,1991,24（3）:50-56.[2] WANG Yue-ijn,HE Pu-chao.Study on inheritance of resistance to powdery mildew in Chinese native wild Vitis L [J] . Scientia Agriculture Sinica, 1997, 30 (1) :19 - 25.王跃进,贺普超. 中国葡萄属野生种叶片抗白粉病遗传研究.[J]. 中国农业科学, 1997, 30 (1) :19 - 25.[3] ZHANG Jian-xia, WANG Yue-jin, XU Yan. The Resistance of Chinese Wild Vitis to Unicinula necator and Its Inheritance of F1 Generation.Scientia Agriculture Sinica. 2001,34（6）:610-614.张剑侠,王跃进,徐炎.国野生葡萄及其 F1 代抗白粉病的遗传表现[J]. 中国农业科学,2001,34（6）:610-614.[4] Nystrom T , Neidhardt FC. Cloning, mapping and nucleotide sequencingof a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Mol Microbiol,1992,6(31):87–98.[5] Nystrom T, Neidhardt FC. Isolation and properties of a mutant of Escherichia coli with an insertional inactivation of the uspA gene, which encodes a universal stress protein. [J]. Bacteriol., 1993, 175(39):49–56.[6] Nystrom T, Neidhardt FC. Expression and role of the universal stress protein, UspA, of Escherichia coli during growth arrest [J]. Mol Microbiol. 1994,11(5): 37–44.[7] Margret Sauter, Guillaume Rzewuski, Tanja Marwedel Rene Lorbiecke. The novel ethylene-regulated gene OsUsp1 from rice encodes a member of a plant protein family related to prokaryotic universal stress proteins［J］. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 2325-2331[8] ZHU Zi-guo，WANG Yue-jin，SHI Jiang-li，WANG Pei-ya， ZHANG Chao-hong.Constructiom of cDNA library of Vitis pseudoreticulata hybrid with resistance to powdery mildew and analysis of express sequence tags［J］. Journal of Fruit Seience .2009,26（1）: 151-157朱自果，王跃进，史江莉等. 华东葡萄抗白粉病杂种后代cDNA 文库的构建及EST 序列分析.[J].果树学报.2009,26（1）: 151-157[9] Zhang Jin-jin,Wang Yue-jin,Wang Xi-ping,Yang Ke-qiang,Yang Jin-xiao.An Improved Method Rapidly Extracting Total RNA from Vitis［J］.Journal of Fruit Science.2003,20(3):178-181张今今 王跃进 王西平 杨克强 杨进孝.葡萄总RNA提取方法的研究［J］.果树学报. 2003,20(3):178-181[10] Nystrom T, Neidhardt FC. Effects of overproducing the universal stress protein UspA, in Escherichia coli K-12.［J］ Bacteriol.1996,178:927–30[11] Gustavsson N., Diez A. A., Nystr?m T. The universal stress protein paralogues of Escherichia coli are coordinately regulated and cooperate in the defence against DNA damage［J］. Molecular Microbiology 2002, 43(1): 107–117[12] Vollmer Cheng Amy，Dyk Van Tina K. Stress Responsive Bacteria: Biosensors as Environmental Monitors［C］／／ROBERT K POOLE. Advance in Microbial Physiology,Department of Biology.Swarthmore College.500 College Aventue. Swarthmore,PA 19081.USA,DuPort Central Reasearch and Development,Experiment Station E173/216,P.O.Box 80173,Wilmington.DE 19880-0173.USA. 49:131-169[13] Alfredo Diez, Niklas Gustavsson ,Thomas Nystr?m. The universal stress protein A of Escherichia coli is required for resistance to DNA damaging agents and isregulated by a RecA/FtsK-dependent regulatory pathway［J］. Molecular Microbiology 2000, 36(6):1494-1503[14] Tian Bin.Genetic Analysis of radA Gene in Sulfolobus Islandicus［D］.Wu Han：Hua Zhong Agricultural University,2009田斌.冰岛硫化叶菌中radA基因的遗传学分析［D］.武汉：华中农业大学，2009[15] Asma Maqbool，Muzna Zahur，Tayyab Husnain，Shiekh Riazuddin.GUSP1 and GUSP2, Two Drought-Responsive Genes in Gossypium arboreum Have Homology to Universal Stress Proteins［J］. Plant Mol Biol Rep 2009,27:109–114[16] Voloudakis AE, Kosmas SA, Tsakas S, Eliopoulos E , Loukas M, Kosmidou. Expression of selected drought related genes and physiological response of Greek cotton varieties[J]. Functional Plant Biol, 2002,29(10):1237–1245.[17] Zegzouti H， Jones B， Frasse P， Maitre C， Latch A， Pech JC，M Bouzayen. Ethylene-regulated gene expression in tomato fruit：characterization of novel ethylene responsive and ripening-related genes isolated by differential display［J］.Plant J,1999,18(6):589–600.Cloning and expressionanalysis of VpUSP gen in Chinese wild Vitis pseudoreticulata
2/2 首页 上一页 1 2 |
