论文导读:：以山核桃(Caryacathayensis)幼胚为外植体，对适宜山核桃胚性愈伤组织诱导的碳源种类进行了筛选，并采用单因子试验对葡萄糖浓度进行了比较分析；在胚性愈伤组织成功诱导的基础上，进一步对山核桃体细胞胚诱导的碳源种类和浓度也进行了测试。结果表明：接种在含葡萄糖培养基中的山核桃胚性愈伤组织诱导率显著高于蔗糖、海藻糖和麦芽糖，诱导率达58.7%；在培养基中添加20g. L-1葡萄糖，胚性愈伤组织诱导率最高，达66.7%，显著高于其它处理。研究发现，蔗糖为山核桃体细胞胚诱导的最佳碳源种类，体细胞胚诱导率显著高于葡萄糖、海藻糖和麦芽糖，诱导率达62.3%；在培养基中添加45g. L-1蔗糖，体细胞胚诱导率最高，达77.4%，显著高于其它处理。
论文关键词：山核桃，碳源，体细胞胚
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)隶属于胡桃科山核桃属，别名小核桃、小胡桃、昌化山核桃。山核桃属植物分布于我国和北美，共18种2亚种，我国分布6种，即山核桃Carya.cathayensis、大别山山核桃C. dabieshanensis、湖南山核桃C. hunanensis、贵州山核桃C.kweichowensis、越南山核桃C. tonkinensis及C. poilane。6个种中以山核桃人工利用时间最长、经济价值最高，已成为产区农民主要的经济来源。长期以来，山核桃主要采用实生与嫁接繁殖。实生繁殖难以保持品种的优良特性[1~2]。山核桃体细胞胚（简称“体胚”）具有完整的两极结构生物论文，能一次再生完整植株论文格式范文。为了满足生产对良种苗木的需要，山核桃的离体繁殖技术得到了较深入的研究。胡桃科中，虽然核桃Juglans regia L.[3]，美国山核桃Carya illinoensis (Wangenh.)K.Koch[4~5]等体胚诱导已有成功报道，但山核桃的组织培养仍停留在愈伤组织[6]及不定芽诱导[7]的阶段。本实验以山核桃幼胚为外植体，通过不同碳源对体胚诱导的影响，来探讨适合山核桃体胚发生的碳源种类与浓度，为山核桃体胚发生体系的建立提供实验平台。
1 材料与方法
1.1 外植体材料的处理
7月上旬于浙江省临安市板桥乡罗塘村采山核桃幼果，带回实验室中剪去花柱及柱头，洗涤剂洗净表面后，75%酒精涮洗30s，自来水冲洗干净，用0.5%次氯酸钠溶液加少许吐温-20，抽真空20 min，无菌水冲洗5-6次生物论文，无菌滤纸吸干表面水分，超净工作台上去除果皮和种皮后取出完整的幼胚作为外植体备用。
1.2 不同种类碳源对山核桃胚性愈伤组织诱导的影响
以蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖（浓度：30g. L-1）5个不同碳源作为5各处理，各处理中培养温度：(25±2)℃，暗培养2d后，放入光暗周期为16h/8h，光照强度：2400-2600lx，pH5.7，琼脂(agar type A)浓度：0.8%。每处理接种幼胚20个，重复3次，接种后前3d外植体每天转接1次，以后每周转接1次。6周后统计诱导率、褐化率。并根据诱导率和褐化率来优化山核桃胚性愈伤组织诱导的最佳碳源种类。
1.3 不同浓度葡萄糖对山核桃胚性愈伤组织诱导的影响
根据实验结果，进一步对最佳碳源即葡萄糖的浓度进行测试，设计单因子实验，浓度采用10、20、40、60、80g?L-1。每处理接种幼胚20个，重复3次生物论文，接种后前3d外植体每天转接1次，以后每周转接1次。6周后统计诱导率、褐化率，获得最好的胚性愈伤组织诱导的葡萄糖浓度。
1.4 不同碳源种类和浓度对体细胞胚的诱导影响
以蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖（浓度：30g. L-1）5种不同碳源作为5各处理，各处理中培养温度：(25±2)℃，光照培养，光暗周期为16h/8h，光照强度：2400-2600lx，pH5.7，琼脂(agar type A)浓度：0.8%论文格式范文。每处理接种20块由幼胚产生的的胚性愈伤组织，重复3次， 3周后统计诱导率、褐化率。并根据诱导率和褐化率得到最优的诱导山核桃体细胞胚碳源种类。
根据得到的最佳诱导体细胞胚碳源进行浓度测试，进行单因子试验，浓度分别为15、30、45、60、75g?L-1。每处理接种20块由幼胚产生的愈伤组织，重复3次。3周后统计诱导率、褐化率，筛选最佳胚性愈伤组织诱导体细胞胚的碳源浓度。
1.5植株再生 将山核桃成熟体细胞胚转至WPM基本培养基中置于光下培养（光照强度：2400-2600lx）。
1.6 数据处理
实验采用单因子设计生物论文，应用SigmaPlot8.0和Spss16系统软件对实验数据进行统计分析并进行显著性分析。实验数据均为3次重复的平均值。诱导率=（诱导出愈伤组织或体细胞胚的外植体数/接种的外植体数）×100%，褐化率=（褐化的外植体数/接种的外植体数）×100%。
2 结果与分析
2.1 碳源对山核桃胚性愈伤组织发生的影响
实验发现，在对山核桃胚性愈伤组织的诱导过程中，葡萄糖的诱导效果明显优于蔗糖、海藻糖和麦芽糖，诱导率达58.7%，褐化率最低，仅为23.3%。进一步进行方差分析和多重比较，葡萄糖与蔗糖、海藻糖及麦芽糖之间存在极显著差异(图1)。相同培养条件下，海藻糖和麦芽糖诱导过程中，幼胚出现玻璃化现象，形成的愈伤组织较少论文格式范文。蔗糖处理下愈伤组织诱导率虽然比海藻糖和麦芽糖高，但愈伤组织继代培养后不易增殖，且玻璃化现象比较严重(图2)。幼胚在含葡萄糖的培养基中培养，2周后开始出现乳白色愈伤组织，4周后出现乳白色至淡黄色愈伤组织生物论文，6周后胚性愈伤组织诱导率达到最高(图3，图版Ⅰ-1)。
 
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图1 不同碳源对胚性愈伤组织诱导的影响
Fig.1 Effect of different carbon sources in embryonic callus induction
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图2 不同碳源对外植体褐化的影响
Fig.2 Effect of different carbon sources in immature embryos browning
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图3 不同种类碳源对胚性愈伤组织诱导
Fig.3 Embryoniccallus induction in different carbon sources
2.2不同浓度葡萄糖对山核桃胚性愈伤组织诱导的影响
在碳源种类筛选的基础上，进一步对不同浓度葡萄糖对胚性愈伤组织的诱导进行试验。结果表明，不同浓度葡萄糖对山核桃愈伤组织诱导影响较大，当葡萄糖浓度为10g?L-1时，诱导率为31.2%，子叶多数褐化。 20g?L-1时诱导率最高，达到66.7%（图4～5），产生的愈伤组织色泽淡黄至金黄、并呈颗粒状结构（图6）。方差分析和多重比较后发现，20g?L-1与其他浓度之间存在极显著差异，但浓度过高也不利于胚性愈伤组织的形成，当浓度为80g?L-1时，大多形成淡灰色至褐色稀泥状非胚性愈伤组织。
 
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图4 不同浓度葡萄糖对胚性愈伤组织诱导的影响
Fig.4 Effect of different concentration of glucose in embryonic callus induction
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图5 不同浓度葡萄糖对外植体褐化的影响
Fig.5 Effect of different concentration of glucose in immature embryos browning
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图6 不同浓度葡萄糖对胚性愈伤组织的诱导
Fig.6Different concentration of glucose in embryonic callus induction
2.3碳源对山核桃体细胞胚发生的影响
实验结果显示，在山核桃体胚的发生过程中，蔗糖对胚性愈伤组织诱导体细胞胚结果最好生物论文，诱导率显著高于葡萄糖、海藻糖和麦芽糖，诱导率达62.3%，褐化率较低，为31.7%。蔗糖诱导发生的体细胞胚呈颗粒状，较为干燥。进一步进行方差分析和多重比较，蔗糖与葡萄糖、海藻糖及麦芽糖之间存在极显著差异。胚性愈伤组织在含蔗糖的培养基中继代培养，2周后出现乳白色至淡黄色颗粒状结构，大部分为球形胚（图版Ⅰ-2），4周后金黄色颗粒状体细胞胚（多数为心形胚至早期子叶胚）诱导率达到最高（图版Ⅰ-4～6）。相同条件下，海藻糖和麦芽糖诱导过程体细胞胚诱导率低，畸形胚较多，同时部分胚性愈伤组织细胞脱分化，形成黄褐色稀泥状非胚性愈伤组织。葡萄糖虽然比海藻糖和麦芽糖高，但培养物易发育形成畸形体细胞胚，且褐化现象比较严重（图7～8）论文格式范文。
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