| 应用DNAman软件分析JWB-NTSH和JWB-NTSX，同源性达到99.37%，通过Blast对比，与报道的植原体相关片段的同源性达到88%以上（表1），说明枣树枣疯病植原体随地域的变异不大，并且变异的区域被发现在几个较为集中的碱基上，使得枣疯病植原体的分类比较容易，有利于进行PCR检测植原体病害的存在。
表1枣疯病植原体与16Sr各组植原体核苷酸同源性分析
Table1AnalysisofNucleotideofJujubeWitchesBroomPhytoplasmaandphytoplasmaof16Srgroup
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亚组分类
subgroup
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相关植原体株系
Associated phytoplasma
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Genbank
登录号
Genbank Accession No.
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核苷酸的同源性
Nucleotide homology(%)
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16Sr Ⅰ-A
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番茄巨芽Tomato big bud(TBB)
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L33760
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89.41%
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16Sr Ⅰ-B
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西方翠菊黄花Severe westem aster yellow(SAY)
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M86340
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89.21%
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16Sr Ⅰ-C
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三叶草绿变Clover phyllody(KVF)
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AF222066
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89.69%
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16Sr Ⅰ-D
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泡桐丛枝Paulownia witches’broom(PaWB)
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AY265206
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89.21%
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16Sr Ⅰ-E
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杏褪绿卷叶Blueberry stunt-16Sr-E
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AY265213
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89.13%
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16Sr Ⅰ-F
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草莓褪绿Apricot chlorotie leaf roll
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AY265211
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89.34%
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16Sr Ⅱ-A
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甘薯簇叶病Sweet potato witchs’ broom(SPWB)
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DQ452417
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88.80%
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16Sr Ⅱ-B
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酸橙丛枝Witches’broom of line (WBDL)
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U15442
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88.73%
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16Sr Ⅱ-C
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蚕豆变叶Faba bean phyllody (FBP)
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X83432
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88.31%
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16Sr Ⅱ-D
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甘薯小叶Sweet potato little leaf(SPLL-V4)
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AJ289193
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88.66%
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16Sr Ⅱ-E
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木瓜黄皱 apaya yellow crinkle(PpYC)
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Y10097
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88.66%
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16Sr Ⅲ
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桃西方X病Peach westem-X disease, WX
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L04682
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92.67%
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16Sr Ⅳ
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椰子致死黄花Coconut lethal yellowing(LY)
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L18747
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93.72%
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16Sr Ⅴ-A
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榆丛枝病Elm witches’-boom（ULW）
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L33763
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98.39%
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16SrⅤ-B
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枣疯病Jujube witches’-broom (JWB )
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AY197661
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99.65%
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枣疯病山西株JWB-NTSH
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GU594058
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99.37%
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16SrⅤ-C
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悬钩子丛枝病Rubus stunt (RuS)
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Y16395
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90.00%
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16Sr Ⅵ
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三叶草簇叶Clover proliferation (CP)
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L33761
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92.74%
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16SrⅦ
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白蜡树黄化Ash yellows(AshY)
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X68339
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95.61%
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16SrⅧ
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丝瓜丛枝Loofah itches’broom(LfWB)
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L33764
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94.77%
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16SrⅨ
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木豆丛枝Pigeon pea witches’boom(PPWB)
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AF248957
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92.26%
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16SrⅩ
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苹果丛簇Apple proliferation(AP)
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AF248958
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90.01%
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16SrⅩI
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水稻黄矮Rice yellows dwarf （RYD）
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D12581
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93.23%
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16SrⅩII
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澳大利亚葡萄黄化Australian grapevine yellows(AGY)
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X76427
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87.87%
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16SrⅩIII
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墨西哥大草白叶Mexican periwinkle virescence（MPV）
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AF248960
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88.45%
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16SrⅩIV
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百慕大草白叶Bermuda grass white leaf (BWL)
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EF444486
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93.23%
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16SrⅩV
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扶桑丛枝Hibiscus witches -broom（HibWB）
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AF147708
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88.66%
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2.4构建系统进化树
将JWB-NTSH和JWB-NTSX同已报道的16SrRNA进行对比，构建进化树，通过软件ClustalX1.81和软件的MEGA4构建进化树从GenBank中挑选植原体16SrDNA的15个种，27条具有确定种属关系的代表性序列（见表1），把这些序列通过ClustalX1.81进行分析，并应用MEGA4软件构建系统进化树。如图3所示，其中JWB-NTSX被划分到16SrDNAV-B中，和已知的枣疯病植原体属于同一个亚种，JWB-NTSH和JWB-NTSX还是有一定的差异性，说明枣疯病植原体随地域的变化可能发生变异，但是变异的碱基比较集中，和Blast中搜索的植原体变异的区域类似，说明同枣疯病植原体序列比较保守，这使得枣疯病的分类比较容易，更有利于枣疯病分类及其检测的研究。
图3枣疯病植原体及相关植原体16SrRNA基因核苷酸序列的系统发育树
Fig.3PhylogenetictreeofJWBandotherrelatedphytoplasmasbasedonthe16SrRNAgenesequences
2.4RFLP模拟
通过软件pDRAW32软件对JWB-NTSH，JWB-NTSX及JWB以及PPWB进行模拟RFLP试验，其中选取已报道的区别16SrDNA种属的17种典型的限制性内切酶。实验结果表明JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB酶切图基本相同，其中JWB-NTSH和JWB在HaeIII和MseI两处不同，JWB-NTSX和JWB在RsaI一处不同。说明JWB-NTSX和JWB的关系比JWB-NTSH和JWB的关系近。而JWB-NTSH和JWB-NTSX均和PPWB的酶切图在AluI、BstUI、DraI、HinfI等处不同，此结果进一步验证系统进化树的分析结果的正确性。说明来自陕西和山西的枣树植原体均属于16SrDNAV-B组。
图4JWB模拟RFLP图图5JWB-NTSHRFLP
Fig．4VirtualRFLPpatternsofJWB-NTSXFig．5VirtualRFLPpatternsofJWB
 
图6JWB-NTSX模拟RFLP图图7PPWB模拟RFLP图
Fig．6VirtualRFLPpatternsofJWB-NTSHFig．7VirtualRFLPpatternsofPPWB
3讨论
本文主要研究的是通过对患有枣疯病的植株进行总DNA提取，利用Lee设计的通用引物对枣疯病总DNA进行PCR扩增，克隆测序，获得16SrDNA的部分序列。通过研究16SrDNA的序列，发现来自陕西和山西不同地方的带病植株，其序列的同源性达到99.37%，与报道的植原体相关片段的同源性达到88%以上。通过查阅植原体16SrDNA相关文献，挑选出植原体16SrDNA的15个种，27条种属明确的代表性序列。通过构建系统分类树，发现JWB-NTSH和JWB-NTSX均属于16SrDNAV-B中，与已经报道的植原体分类相符合。同时挑选出关于植原体16SrDNA分类的典型的17种限制性内切酶，模拟RFLP对其分类做进一步验证，JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB酶切图基本相同，而JWB-NTSH和JWB-NTSX均和PPWB的酶切图在AluI、BstUI、DraI、HinfI等处不同,说明JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB亲缘关系比较近，和PPWB的亲缘性较远，此结果和构建的系统分类树分析结果是一致的，所以枣疯病植原体应该被分到16SrDNAV-B组中，为枣疯病植原体的分类提供可靠的分子水平的理论依据。
4结论
近年来，新疆枣树产业不断的发展，枣疯病的研究就显得极其重要。目前我们在新疆南疆发现具有枣疯病症状的植株，本文通过对枣疯病植原体16SrDNA进行PCR扩增检测，并且通过构建其系统分类树和模拟RFLP实验，确定出枣疯病植原体的变异随地区差异性较小，并进一步确定其属于16SrDNAV-B组，为建立更为灵敏准确的枣疯病检测体系建立理论基础。
参考文献
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10 LIU Yong-guang,TIAN Guo-zhong,WANG Jie,LI Xiang-dong,ZHU Xiao-ping,SHU Huai-rui. Molecular identification of Pathogen causing mulberry yellow dwarf disease in Shandong Sericultural areas.Science of Sericulture,2009,35(3):463-471 2/2 首页 上一页 1 2 |
