论文摘要：本文根据植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1，对陕西和山西具有枣疯病的植株的总DNA进行PCR扩增，分别得到1433bp和1432bp的条带，其二者同源性达到99%以上。通过此16S rDNA序列进行Blast检索，挑选27条关于16S rDNA具有明确分组的植原体序列，分析同源性并绘制其系统进化树，结果表明它们和16S rDNA V-B组的遗传距离最近。通过pDRAW32软件，用17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶模拟RFLP，结果表明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似。进一步验证枣疯病植原体属于16S rDNA V-B ，说明其地域变异性不大，有利于枣疯病检测技术的建立。
论文关键词：枣疯病,植原体,分子检测,同源性
前沿
枣树原产我国，具有较高的营养价值。近年来，随着生活水平的提高，枣产品的需求量不断增加，枣树的栽培面积迅速扩大。新疆近年来也大力发展枣树产业，使得枣产业在新疆果业中占有一定份量。但是随着种植面积的增大，枣树病害也成为制约枣产业发展的一个重要因素。枣疯病堪称枣树的“艾滋病”，是一种毁灭性病害。目前没有比较实效的根治方法，所以通过PCR技术检测枣疯病就显得更为重要。
枣疯病病原是类似于菌原体的一种极小的微生物，1994年第十届国际菌原体组织大会上改称为植原体。植原体属于柔膜菌纲、植原体属，是一类无坚固细胞壁、存在于植物韧皮部筛管细胞内的原核生物。本文通过获得枣疯病植原体的16SrDNA序列，对枣树的植原体进行同源性分析，构建其系统进化树，为建立更为有效的枣疯病检测体系奠定理论基础。
1材料与方法
1.1实验材料
分别在2009年7月在陕西和山西采取具有枣疯病症状的植株，在石河子大学试验站采取健康植株，保存在-70℃冰箱里。
1.2实验方法
1.2.1枣树总DNA的提取
称取0.1-0.2g叶片，在液氮中迅速研磨至粉末，将粉末迅速转入预冷的1.5mL离心管中，加入1mlSTE(700mmol/LNaCl，100mmol/L，100mmol/LTris-Cl和50mmol/LEDTA)，再加入5μLβ-巯基乙醇(BME)，迅速混匀，在4℃下7000r/min离心6min，弃上清液，加人700mL预热的CTAB提取缓冲液(100mmol/LpH8.0Tris-Cl，50mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2%PVP，3%CTAB，2%BME)和12.5μL的BME，迅速摇匀，在65℃水浴30min（每8-10min上下颠倒一次），水浴结束后，加入等体积氯仿-异戊醇(24:l)后轻轻混匀，4℃离心10min。取上清液至1.5ml离心管中，同上再抽提一次。加入1/5体积的5mol/LNaCl混匀，再加2/3体积冰冷的异丙醇，-20℃静置20min以上。最后12000r/min离心5min，用75%的乙醇清洗2-3次，在室温下干燥10min，使其尽可能干燥。最后加入含有RNase的TE溶解，并置于37℃水浴30min。电泳检测，保存在-20℃即可。
1.2.2PCR扩增
根据Lee报道的关于16SrDNA的引物对：R16mF2（5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’），R16mR1(5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’)进行PCR扩增，以健康样品的总DNA和水为阴性对照，以带病样品的总DNA为阳性对照。反应体系为20µL，含有2µL10×PCRBuffer、1µL20µmol·L引物R16mF2、1µL20µmol·L、引物R16mR1、0.8µL0.25UdNTP、0.2µL1.25UTaqDNA聚合酶（上海生工公司），2µL枣树总DNA，13µLddHO。PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃45s，56℃45s，72℃1min35个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（EB染色），紫外透射仪下观察，并拍照记录实验结果。
1.2.3克隆测序
用百泰克的凝胶回收试剂盒回收目的片段，对其连接转化涂板。用碱式裂解法，提出含有目的片段的质粒DNA,并且对其用R16mF2/R16mR1引物对进行PCR扩增，验证目的片段是否已经连接上。最后送往上海生工进行测序。
1.2.4目的片段的序列分析
将所得的目的片段，进行Blast检索分析，并把测序结果登录在GenBank中，通过挑选较为典型的序列，ClustalX1.81对其多条序列进行分析，通过MEGA32软件构建系统进化树。挑选AluⅠ、MseⅠ和Tsp509Ⅰ等17种限制性内切酶，利用软件pDRAW32模拟RFLP，分析确定其种属关系。
2实验结果
2.1DNA的提取
通过CTAB法，提取的DNA如图1，由于植原体在枣树中分部不均匀，应该根据不同时期采取不同组织，本实验采取样品为叶子和枝条。通过对总DNA的粗提取物和总DNA提纯后的物质进行比对，由于枣树含糖量比较高，所以提纯后DNA的电泳效果较好，但是进行PCR比较，未测发现二者差异性，是否提纯DNA对实验的影响不大。此方法可以应用于枣树总DNA的提取中。
2.2PCR检测
通过对带病的两个不同品种进行PCR检测，均可以扩增出1400bp左右的大小条带，而健康植株中和水中均不能扩增出此特异性片段，说明患有枣疯病的枣树中含有植原体（图2）。
图1枣树总DNA提取电泳图谱图2枣疯病植株总DNA的PCR产物电泳图谱
Ck：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株CK1：水CK2：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株Fig．1ElectrophoresispatternofFig．2ElectrophoresispatternofPCRproductsof
totalDNAfromJujubetotalDNAfromJWB
CK：healthyJujubeSX：JWBfromShaanxiCK1：DoubledistilledwaterCK：healthyJujube
SH：JWBfromShanxiSX：JWBfromShaanxiSH：JWBFROMShanxi
2.3测序检测及同源性分析
通过上海生工进行测序，在陕西和山西的材料中分别获得1433bp（JWB-NTSH）和1432bp（JWB-NTSX）两条不同的片段，GC含量较高，在GenBank中的登录号分别为GU594058、GU574807。 1/2 1 2 下一页 尾页 |
