| 5、1、3、6、12和24h取样。
低温处理：称取3个2周幼苗样品；将样品置于4℃处理，分别在0.5、1和3h取样。
脱水处理：称取3个2周幼苗样品；将样品放在滤纸上，并置于长日照培养室中，分别在0.5、1和3h取样。
损伤处理：先用带有锯齿的镊子夹伤生长在培养基上的2周幼苗，然后置于长日照培养室中，分别在0.25和0.3h取样。
2.4 IQM4基因的RT-PCR分析
参照RNAiso Plus说明书提取非生物胁迫处理的样品总RNA。
以IQM4编码序列的特异引物F1：5’-AGTTAGCTCTTCAGCATTGGC-3′和R1：5’-TCTTCTTGTTCCTCTGTAACG-3′进行半定量RT-PCR，分析样品中IQM4的表达水平。实验以拟南芥β-ATPase基因设计了内标引物F2：5’-CTGAATCAATCTCTTAAGCTG-3’和R2：5’-GTGCAGA AAGTTCTACAGAACTAC-3’。RT-PCR采用PrimeScript One StepRT-PCR Kit，每个反应以100 ng总RNA为模板，总反应体积为20 μL，扩增参数为①50℃ 30min，②94℃ 2min，③94℃ 30s，④54℃ 30s，⑤72℃ 40s，③④⑤ 31次循环，⑥72℃ 5min。反应结束后，取扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并用凝胶成像系统拍照保存。
3 结果与分析
3.1 生物信息数据库中IQM4基因表达数据分析
讨论
已知拟南芥IQM家族在植物对光、生物和非生物胁迫反应中发挥重要作用[7]。半定量RT-PCR结果验证了生物信息数据库的资料，结果表明拟南芥IQM4基因表达受到盐和渗透胁迫、脱水、低温和机械损伤等非生物胁迫因子的影响，初步证明IQM4基因在植物非生物胁迫中发挥重要作用。
实验发现RT-PCR分析结果与数据库的数据有部分偏差，如盐胁迫处理RT-PCR结果是胁迫0.5h和1h后IQM4基因表达明显上调，而数据库的资料则为胁迫1h后IQM4表达量显著降低。RT-PCR结果显示渗透胁迫明显抑制IQM4表达，而数据库的资料则为渗透胁迫0.5h和1h后显著增强IQM4基因表达量。数据库的资料显示机械损伤明显增强IQM4表达水平，但RT-PCR结果则是表达水平有所下降。我们推测RT-PCR结果与数据库的资料出现偏差的原因可能是因为实验材料的取样部位不一致造成的，数据库数据的取材为幼苗地上组织，而本实验是以整株幼苗为实验材料。
【参考文献】
[1]韦慧彦，郭振清，崔素娟.钙不依赖性钙调素结合蛋白的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2007，34（2）：124-131.
[2]田长恩，周玉萍.植物具IQ基序的钙调素结合蛋白的研究进展[J].植物学报，2013，48（4）：447-460. 2/2 首页 上一页 1 2 |
