| 靶核酸直接扩增包括聚合酶链式反应、链替代扩增、连接酶链式反应和核酸依赖扩增、转录介导扩增和滚动环扩增；另一类是信号放大扩增：包括支链DNA、侵染探针和滚动环扩增等。分子生物学方法在致病菌检测领域，得到了很好的应用[7]。
2.1 聚合酶链式反应（PCR）
1985年，Mullis等人发明了PCR技术，相对而言，PCR技术具有特异性高、灵敏度好、操作简单、重复性好的优点。PCR是一种DNA体外复制技术，通过复制放大，扩增目标互补DNA片段，以微量的DNA为起点，获得大量的复制DNA。PCR的基本原理和DNA复制过程相似，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。一般分为三个阶段：加热模板DNA发生变性；冷却使模板DNA与引物互补序列配对结合；在适度的温度下进行引物的延伸。重复这三个过程能获得更多半保留复制链，从而能在短时间内将目的基因扩增放大几百万倍，PCR技术主要应用于单管PCR产物的实时荧光检测。
2.2 连接酶链式反应（LCR）
1987年，Backman研究发明了LCR方法技术。1991年，Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶延伸了LCR试验，为LCR的实用发展奠定了基础。LCR技术依靠碱基的互补配对原理开展检测，在DNA连接酶的作用下，通过连接与模板DNA互补的两个相邻寡核苷酸链，进行DNA片段的快速扩增，从而复制出大量靶基因。
2.3 环介导等温扩增技术（LAMP）
2000年，Notomi等首次提出LAMP技术，LAMP技术依靠能对靶序列上的6个独立区域特异性识别的4种引物，及具有链置换活性的DNA聚合酶，通过循环链置换反应，达到靶序列的扩增。反应包括两个阶段，循环扩增始发物的形成与循环延伸。首先，由外部引物扩增出内部引物所需的模板，接着内部引物对靶基因片段进行引导合成。如此循环反应最终形成带有类似花椰菜的茎-环结构，该法可在短时间内实现109—1010倍的扩增。Malcolm等首次结合多重PCR技术和LAMP方法，构建了副溶血性弧菌的定量检测体系[9]。Lee结合LAMP和免疫层析技术，以未前处理的全血和牛奶为检测对象，实现了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7的检测[10]。LAMP方法是一种快速简便、省时省力、特异性好、灵敏的致病菌检测技术。
2.4 滚动环式扩增（RCA）
RCA是一种较新的恒温核酸扩增技术，原理类似于噬菌体复制过程，它以环形DNA为模板，通过一个与部分模板DNA互补的较短DNA引物，在酶的催化下将dNTPs转变成包含无数个能与模板互补的单链DNA片段，因此，它既可以进行靶核酸基因的扩增，又可以进行型号的放大扩增。滚动环式扩增分为两种形式：线性扩增和指数扩增。线性扩增是指引物结合到模板DNA后，在酶的作用下，产物具有无数个能与模板互补的线状单链DNA片段，线性RCA仅仅适用于一些具有环状核酸的病毒、染色体的扩增。RCA可以使产物呈线性增加，因此可以用于靶核酸的定量检测。指数扩增的原理与线性扩增基本相同，只是采用与模板DNA序列完全相同的引物，在酶作用下延伸，其产物作为探针模板；因此，在很短的时间里可以使产物呈现指数递增，指数扩增常用于非环状DNA的扩增。
2.5 基因芯片技术
DNA微阵列又称DNA阵列、DNA芯片、基因芯片，最早出现在80年代中期。基因芯片的基本原理是杂交测序法，一般来说基因芯片是指带有适配体涂层的特殊物体；具体地说，基因芯片能够识别特定基因表达、基因序列，最常见的基因芯片是指将单链DNA探针固定在其上的特殊玻璃片。近年来，有越来越多的研究团队运用基因技术检测食源性致病菌，Seung Jun Oh等设计制备了圆形微流控芯片，该芯片借助LAMP和铬黑T光学手段实现了多种致病菌的甄别和检测[11]。YongTae Kim等结合固相萃取、聚合酶链式反应和免疫层析技术，构建了多种致病菌的光学检测体系，检测过程可在55分钟内完成，检测限达5 cell[12]。基因芯片技术能够获得目标物详细的基因信息，包括相关识别因子、类型、致病因子和抗生素抗药性等。但它存在成本高、检测能力有限、重现性低等缺点，因此，代写毕业论文基因芯片技术在致病菌检测中的运用还需要进一步研究[13]。 2/2 首页 上一页 1 2 |
