植物乳杆菌R23酵解枇杷果汁有机酸的动态分析_杂志网

论文导读:：以“早钟六号”枇杷果汁为原料，采用植物乳杆菌R23进行乳酸发酵，应用 HPLC法分析了发酵过程的有机酸变化，并研究了接种量和枇杷汁原果酸含量对酸代谢的影响。结果表明：植物乳杆菌R23酵解枇杷果汁过程表现为先降酸后产酸，在发酵前期是以苹果酸为主要碳源进行苹果酸-乳酸发酵（MLF），苹果酸大量减少，而乳酸、琥珀酸含量增加，果汁的总酸下降；MLF结束后，植物乳杆菌R23以糖代谢为主，除乳酸外，主要产物为乙酸，果汁的总酸增加；较大起始菌量和较高枇杷原果酸都能提高降酸和产酸的速率，但果汁中苹果酸含量则是决定降酸幅度的主要因素。
论文关键词：枇杷，果汁，乳酸发酵，有机酸，苹果酸-乳酸发酵
 

乳酸菌发酵果蔬汁，不仅可提供愉快的乳酸发酵风味物质，而且可产生人体所必需的多种维生索、乳酸菌素、消化酶等物质，从而赋予饮料整肠、健胃、助消化及提高机体免疫能力的功效^【1-2】杂志网，深受广大消费者所青睐。以胡萝卜^【3】、南瓜^【4】、花椰菜^【5】 、番茄^【6】、竹笋^【7】、金丝枣^【8】等果蔬为原料，通过添加乳粉启动乳酸发酵或者用果蔬汁替代部分牛奶进行发酵的乳酸发酵果蔬汁加工工艺已有研究报道，研究均是直接应用酸奶发酵所用乳酸菌种，而以果蔬全汁乳酸发酵及其发酵过程糖、酸等营养物质消长规律的研究未见报道。枇杷果实营养丰富，果实甜酸适度，果肉柔软多汁，具有润肺、止渴、和胃、清热等作用，深受人们喜爱。目前枇杷的加工制品主要有罐头、果汁饮料、枇杷酒及醋饮料等^【9-11】杂志网，但未见乳酸菌发酵枇杷果汁的产品及其研究报道。枇杷果实直接用于果汁饮料的加工，存在枇杷果香不足的缺陷，本课题组对枇杷果汁进行乳酸发酵，从而赋予枇杷果汁愉快的发酵香，且发酵香果香协调。本文以具有苹果酸-乳酸发酵（MLF）能力的植物乳杆菌R23菌(Lactobacillus plantarum R23)发酵枇杷果汁，研究发酵过程有机酸动态及变化规律，为进一步研究发酵果汁的风味物质和研发具有果香及发酵香协调的枇杷乳酸发酵饮料提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1 枇杷果汁

福建莆田产的“早钟六号”枇杷鲜果为原料，去除青果及病、虫、烂果杂志网，按成熟度分为七成熟和九成熟，其总酸含量分别为0.78%、0.41%。果实去皮、去核后，护色破碎榨汁，分装在1L发酵瓶中加硅胶塞，于100℃水浴杀菌10min，冷却，备用。

1.1.2 乳酸菌

植物乳杆菌R23(Lactobacillus plantarum R23)，福建省农业科学院农产品加工研究中心选育并保存。

1.1.3 扩大培养基LH16^［1、2］

番茄汁10%、酵母膏0.74%、牛肉膏1%、葡萄糖3%、MgSO₄ 0.036%、苹果酸钠2%、吐温-80 0.1%、胰蛋白胨1.5%、柠檬酸铵0.2%杂志网，调整pH至4.8±0.2，121℃高压灭菌10min。

1.1.4种子液

将植物乳杆菌R23接种到培养基LH16，于25℃下培养24h。菌密度达到10⁹cfu/mL以上，3000rpm离心5min，取菌坭加适量杀菌过的枇杷汁振荡悬浮，待用。

1.2试验方法

将种子液接入“早钟六号”枇杷果汁中，于25℃下静态发酵，在无菌状态下按时取样杂志网，样液经3000rpm离心10min后冷冻保藏，用于测定总酸、总糖、有机酸含量及组分、MLF纸层析定性分析。每处理重复3次。

1.3 检测方法

1.3.1总酸（TA）：GB12293-90《水果、蔬菜制品可滴定酸的测定》，以苹果酸计。

1.3.2苹果酸-乳酸发酵（MLF）：纸层析法定性分析^【13】。

1.3.3 可溶性总糖（SS）：GB/T6194-86《水果、蔬菜可溶性糖测定方法》，以葡萄糖计。

1.3.4 有机酸组分及含量：HPLC法，参照林维宣等^[14]的测定方法略作修改。

1.4主要仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱系统，Waters 2487紫外检测器，Empower Pro色谱工作站，反相C18色谱柱。有机酸组分（奎尼酸、草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸、甲酸）杂志网，sigma标准品；其他试剂均为国产AR级以上。

1.5数据处理

试验数据采用DPS软件处理分析。

2 结果与分析

2.1乳酸发酵过程有机酸的动态分析

表1 枇杷果汁乳酸发酵过程有机酸组分的变化（mg·mL^-1）

Table 1 Changes of organic acids duringlactic fermentation

“早钟六号”枇杷果汁的有机酸是以苹果酸为主，约占总酸的72%，其次是奎尼酸、琥珀酸、乳酸，这与何志刚^【15】、陈发兴^【16】对“早钟六号”枇杷果肉有机酸组分的研究基本一致。含总酸0.78%的枇杷汁在接入菌量10⁸cfu/mL的植物乳杆菌R23，经25℃发酵24h，5.627mg/mL的苹果酸基本消耗完全，代谢产物乳酸含量增加了3.443mg/mL，琥珀酸含量比未发酵前增加了3.8倍杂志网，其它有机酸均未明显变化。发酵24h后，乳酸得到进一步积累，且随着发酵时间的延长呈增加趋势，同时伴随着乙酸含量增加；葡萄糖三羧酸循环（TGA）的中间产物琥珀酸、柠檬酸、苹果酸^【17】也略有增加，这与李华^【18】对葡萄酒MLF的研究一致。由于1g苹果酸经MLF可生成0.67g乳酸^【19】，说明发酵前24小时的乳酸增加，主要是乳杆菌R23以苹果酸为主要碳源经苹果酸-乳酸发酵（MLF）生成。MLF结束后，植物乳杆菌R23进行糖代谢杂志网，产物除乳酸外，主要为乙酸，果汁总酸持续增加。

2.2 接种量对酸代谢的影响

以含酸为0.41%的“早钟六号”枇杷原汁为原料，分别以10⁷cfu/mL及10⁸cfu/mL的生物量接种进行乳酸发酵。结果见图1和表2：两个接种量的果汁在乳酸发酵过程中，总酸的变化均表现为先降后升趋势，降酸及产酸幅度也无明显差异；但起始菌量10⁸cfu/mL的处理可提前8h左右完成MLF，且降酸速率及产酸速率均大于10⁷cfu/mL接种量的处理。试验表明：较大起始菌量能提高降酸和产酸的速率，这与张春晖等^【20】在葡萄酒中MLF的研究结果一致。

表2 苹果酸-乳酸发酵（MLF）纸层析

Table 2 Paper chromatographyof MLF

PS：“＋”表示有层析点杂志网，“－”表示无层析点。

3.3原果酸含量对乳酸发酵酸代谢的影响

以七成熟及九成熟的早钟六号枇杷为原料分别制备果汁进行乳酸发酵，结果见图2。七成熟果实制备的果汁含酸0.78%，进行乳酸发酵完成MLF所需时间即出现拐点的时间比九成熟枇杷制备的果汁要多8h，MLF结束后总酸下降了0.26个百分点，而含酸0.41%九成熟果汁仅降了0.1百分点。这是因为枇杷成熟度越低，含酸量越高，果汁所含苹果酸也越多，因此完成MLF所需时间更长杂志网，降酸幅度也大，从而说明发酵基质中苹果酸含量是乳酸发酵降酸幅度的决定因素。在随后的糖发酵过程中，两者产酸幅度接近，都比MLF结束时提高了0.41～0.42个百分点，但成熟度低的果汁总酸含量仍然低于成熟度高的果汁，可能其与产物乳酸的抑制有关。

4.讨论

果酸是主要的呈味剂，果实中不同的果酸组成及含量构成了果实的特征风味之一。枇杷果实中的果酸中主要为苹果酸，为MLF乳酸菌进行枇杷乳酸发酵奠定了物质基础。发酵前期进行的MLF是将苹果酸(二元酸)经脱羧作用转化为乳酸(一元酸)^【17】杂志网，因此表现为苹果酸减少而乳酸增加的降酸过程。当苹果酸等有机酸组分被消耗完后，乳酸菌将继续分解碳水化合物、氨基酸等营养物质而产生乳酸，果汁酸度进而平稳上升，但碳水化合物的代谢会产生乙酸，当乙酸含量达到阈值会产生不良风味，即出现发酵过度；接种量虽然不影响乳酸发酵过程的降酸及产酸幅度，但对降酸及产酸的速率有明显影响；枇杷果实成熟度低，则果汁的总酸及苹果酸含量高而碳水化合物少，发酵产物-乳酸占总酸的比例就小。因此，要获得风味良好的枇杷果汁乳酸发酵液，研发果香及枇杷香协调的发酵型果汁饮料，避免发酵过度，可根据果汁的含酸量，调控接种量、发酵温度及发酵时间等因素来现实，本研究内容将另文报道。

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