论文导读：药物葛根素广东省药品检验所批号:180752-200809。在共育体系中，成骨细胞在5～100μg/ml的葛根素中培养7d后产生促明显的增殖作用。其中以100μg/ml促增殖作用最强。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志。
关键词：葛根素，成骨细胞，破骨细胞，增殖，分化
葛根素(Puerarin)是葛根中具有异黄酮结构的主要活性成分之一，有研究表明，葛根素具有预防骨质疏松的作用 [1]。本文观察了葛根素在成骨-破骨细胞共育体系中对大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响, 以评价其对骨代谢的作用。
1材料
1.1动物普通级1日龄Sprange-Dawley(SD)新生大鼠和5日龄SD新生大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：2008B006。
1.2药物葛根素 广东省药品检验所 批号: 180752-200809。
1.3试剂DMEM培养基（GIBCO公司），0.25%胰蛋白酶(Amersco公司)，Ⅱ型胶原酶（Sigma公司），碱性磷酸酶试剂盒(Sigma公司)。
1.4仪器超净工作台(苏州净化设备厂产品)，倒置相差显微镜(Nikon产品)，CO2培养箱(ThermoForma公司产品)，细胞培养板(Costar公司产品)， 0.45μm过滤膜(Costar公司产品)，紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。论文格式。
2方法
2.1分离培养OB 参照文献[2]。
2.2分离培养OC 参照文献[2]。
2.3共育体系的建立
在已制作好并消毒的24孔共育培养板，以3×104个/孔的密度将OB接种到OB培养室内，以3×104个/孔的密度将OC接种到OC培养室内，每20min观察一次OC贴壁情况，同时观察是否有细胞透过半透膜进入OC培养室。
2.4MTT法测定葛根素对OB增殖的影响
取第三代OB以3×104个/孔的密度接种于OB 培养室，3h后，将新分离的OC以3×104个/孔接种于OC培养室；24h后换入无血清培养液，待细胞周期同步化后，更换为不同浓度的葛根素培养液。各剂量组的终浓度分别为0.05ug/ml、0.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。每个浓度设6个复孔。分别培养7天，更换无血清的DMEM培养基400ul，同时加入5mg/mL的MTT80ul/孔，置37℃，5% CO2培养箱中孵育4h后，在酶标仪上测OD值，波长为570nm。参比波长为630nm。论文格式。
2.5PNPP法检测葛根素对OB ALP活性的影响
取第三代OB以5×104个/孔的密度接种于OB培养室，3h后，将新分离的OC以5×104个/孔接种于OC培养室；待细胞周期同步化后，再分别加入0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml的葛根素，与空白组对照。培养7d后，加入500ul 0.1%TritonX-100作用30min, 收集细胞裂解液，采用ALP试剂盒检测其活性。
3结果
3.1葛根素对成骨细胞增殖的影响
在共育体系中，成骨细胞在5～100μg/ml的葛根素中培养7d后产生促明显的增殖作用。其中以100μg/ml促增殖作用最强。而0.05μg/ml、0.5μg/ml的葛根素作用无明显差异。见表1。
表1不同浓度的葛根素对OB增殖的影响(X±S，n=6)
| 组别 |
空白组 |
0.05μg/ml |
0.5μg/ml |
5μg/ml |
10μg/ml |
50μg/ml |
100μg/ml |
| OD值 |
0.256± 0.093 |
0.279 ±0.039 |
0.302± 0.021 |
0.326± 0.041** |
0.338±0.029** |
0.432±0.024** |
0.572±0.030** |
3.2葛根素对成骨细胞ALP活性的影响
碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志。在共育体系中，成骨细胞在不同浓度葛根素的培养下7d，发现5μg/ml、50μg/ml浓度呈现明显的促分化作用，其它浓度作用无显著差异，见表2。
表2各实验组碱性磷酸酶活性测定（ ，n=6）
| 组别 |
空白组 |
0.5μg/ml |
5μg/ml |
50μg/ml |
| ALP( 金氏单位) |
1.541±0.142 |
2.664±0.453 |
3.241±0.581** |
4.256±0.187** |
4讨论
在正常生理条件下，骨组织中OB与OC间的功能活动并不是相互孤立存在的，骨组织的代谢依赖这两种细胞的相互作用；OB介导的骨形成与OC介导的骨吸收相互耦联，使骨重建处于一种动态平衡中，从而维持机体骨量与骨密度的正常。本实验研究注重OB和OC两者之间的相互作用，建立体外OB和OC联合培养体系以反应骨代谢的实际情况。
ALP是一种普遍存在的细胞内酶，是OB功能及分化的早期指标之一。论文格式。ALP在细胞中的表达多少，可反映出OB的分化程度和功能状态，ALP活性越高，说明前OB向成熟的OB分化得越明显[3]。
本实验研究表明葛根素在共育体系中对大鼠OB有明显的促增殖作用。葛根素对OB ALP的影响随浓度增强而增强，表明葛根素能够促进OB合成和分泌ALP，提示葛根素可能通过促进OB的增殖和分化来增加OB的数量, 从而具有促进骨形成的作用。臧洪敏等[4]研究证实葛根素具有刺激OB增殖，提高ALP活性，与本实验结论相吻合。
本实验在细胞水平观察了葛根素对OB的直接作用，说明其预防骨质疏松的作用机制与其促进成骨细胞的增殖、分化的作用有关，为葛根素预防骨质疏松症提供了理论和实验依据。
参考文献
[1]王新祥,张允岭,吴坚,等. 葛根对骨质疏松模型小鼠骨密度和骨组织构造的作用[J].中国骨质疏松杂志.2008，14(5):349-353.
[2]薛庆善主编. 体外培养的原理与技术. 北京：科学出版社，2001年第1版：485-486.
[3]Aubin JE. Advances in the osteoblast-linage [J].Biochem Cell Boil, 1998, 6(6): 899-910.
[4]臧洪敏,陈君长,刘亦恒,等.葛根素对成骨细胞生物学作用的实验研究[J].中国中药杂志.2005,30（24）:1947-1949.
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