基因RASSF1B、RASSF1F在肿瘤细胞中转录表达及临床意义

论文导读:：株肿瘤细胞总RNA的提取结果。基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。
论文关键词：肿瘤细胞，RASSF1基因家族，转录，RAS家族

 

近年来较多研究都发现染色体3P21.3等位缺失在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌等常见肿瘤中频繁发生，推测该位点可能存在一个或多个肿瘤抑制基因。2000年，Dammnn等 ^[1]利用酵母双杂交筛选的方法从3P21.3内120 kb长最小纯合缺失区分离出一种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因，由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)与小鼠RAS相关区域家族1（RAS association domainfamily 1）与小鼠RAS效应蛋白Nore1高度同源，遂命名为RAS相关区域家族1，即RASSF1基因。由于选择性剪切和不同启动子的使用，RASSF1基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。有研究发现RASSF1能直接参与细胞周期的调控医学论文，在体内和体外能抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡^[2]。

最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因段的丢失，DNA核苷酸序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与抑癌基因DNA核苷酸序列中的胞嘧啶核苷酸（C）和鸟嘌呤核苷酸（G）二联连结中（CpG）的胞嘧啶碱基环中的第5位碳原子上所发生的甲基化具有极其重要的相关性^[4]。抑癌基因R ASSF1的表达作用机制已经初步明确,但其转录本基因在恶性肿瘤中的作用研究较少，尤其是RASSF1B,RASSFIF在肿瘤细胞中的表达比较还未见相关报道。本文旨在通过RT-PCR的方法，检测五种常见的肿瘤细胞中RASSF1家族中RASSF1B,RASSF1F不同转录本的表达情况，为基因治疗提供理论基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

5株肿瘤细胞AGS（胃腺癌）、95D（高转移肺癌）、LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)和U937（白血病细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MMLV反转录试剂盒购于Promega公司。

1.2细胞培养

试验所选用的五种肿瘤细胞用DMEM(Invitrogen)加10 %小牛血清，CO₂培养箱中37 ℃恒温培养至细胞均匀覆盖细胞瓶约3/4。

1.3cDNA的制备

以Trizol提取的方法提取细胞总RNA并纯化, 用MMLV反转录得到五种肿瘤细胞的cDNA。

1.4 RT-PCR

利用DNAstar软件设计RASSF1家族两种转录本的特异引物，以人β－actin为内参，通过RT-PCR方法检测这两种转录本在五种肿瘤细胞中的表达情况论文的格式。引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s 医学论文，72 ℃ 1.5 min 30个循环，72 ℃ 10 min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 应用生物信息学软件分析7种转录本的剪切方式。

2 结果

2.1 两种转录本的读码框结构的比较

表1 扩增RASSF1的两种转录本的引物设计

根据GenBank中搜索的结果，通过公布的2种RASSF1的异构体。其中,两种转录本主要的差别在于中部存在少数氨基酸的不同剪接方式。RASSF1B为N端缺失，RASSF1F缺失了C端的大部分氨基酸（见图1和表1）。

图1 RASSF1的7种转录本的氨基酸结构示意图。(其中B,F分别表示RASSF1B,RSSF1F)

代表各自特异的氨基酸序列；结构框上端的数字代表发生变异的氨基酸位点，最后的数字为其读码框的长度；交叉线代表缺失的氨基酸，下端的数字为缺失的氨基酸数目。

2.2 5株肿瘤细胞总RNA的提取结果

提取了5株肿瘤细胞的总RNA。凝胶电泳的结果显示，28S和18S条带较为明显， RNA的完整性和质量较好（见图2）。为进一步证实，采用核酸检测仪（Gene Spec III）检测，A260/A280值均在1.9 –2.0之间，其结果与电泳的结果一致，各项指标均达到反转录要求。

图2 琼脂糖电泳检测总RNA

2.3 2种转录本在5种肿瘤细胞中的表达状况

以5株肿瘤细胞反转录获得的cDNA为模板，应用RT-PCR方法检测上述2种转录本的表达状况（见图3）。转录本B和F在AGS（胃腺癌）肿瘤细胞中均未见表达。而其他转录本在肿瘤中的转录有差别，转录本B和F在95D（高转移肺癌）细胞中均有表达医学论文，表达的强度差别不大，在LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)细胞中转录本B表达较高，而转录本F在此两种肿瘤细胞中未见表达或表达量很低,转录本B和F白血病细胞U937中有转录。且转录本B表达强度较大.从细胞系分析，在此实验中胃癌细胞AGS几乎没有RASSF1B,RASSF1F的转录现象。提示2种类型转录本可能与胃癌发生呈负相关。在肝癌和肺癌中2种转录本基因表达结果完全不同,所起的作用可能不同.

图3 2种转录本在不同肿瘤细胞系中的PCR扩增比较

细胞：A，AGS；D，95D；H，HEPG2；L，LTEP-a-2；U，U937； B－F表示RASSF1的各种异构体，±表示微量扩增，- 表示阴性，+ 表示阳性。

3 讨论

RASSF1B是Ras家族相关的基因主要转录本之一,其编码三个结构域依次为1β、2αβ和外显子3—6的cDNA全长为1664bp，包含外显子2γ和外显子3—6，只编码RAS相关区域。其生物学功能在进研究中,在研究中发现该基因含有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。Ras区域是该家族共有的区域。而RAS通路是所有细胞都具有的一条高度保守的信号传递通路论文的格式。蛋白在有活性的GTP结合构象和无活性GDP的结合构象之间转化, 通过与不同的效应物分子激活多条信号传递通路”有关文献报道医学论文，RASSF1B是通过该区域以GTP方式直接与Ha-Ras相结合^[3]。而SARAH区域可以调节细胞信号转导^[11]。其机制可能与以下途径有关：(1) 活化的Ras蛋白具有促进生长增殖的作用，RASSF1基因可能通过抑制了Ras的激活途径而抑制生长、促进细胞凋亡；(2) RASSF1能通过阻断CyclinD1的积累及细胞周期G1/S期的进展而一步抑制肿瘤生长^［4］。 RASSFIF是RASSF1基因家族中研究较少的转录本基因,仅在部分肿瘤细胞中被发现,现已明确部分RASSF1基因家族失活主要机制是由于启动子区5′CpG岛的异常高甲基化所致 RASSF1家族高甲基化能通过DNA自身化学修饰方式而抑制RASSF1基因家族的转录使其表达缺失，丧失了负性调控细胞周期的功能，使细胞易于发生恶性转化，促进肿瘤的发生与发展^［5］。目前关于RASSF1F基因在正常组织及肿瘤组织中表达情况及生物学功能研究还未见报道。

目前已发现的各转录本的结构分析，B和F型是较主要的转录本。该类型则可能是由基因突变所致。结合本实验应用RT-PCR的方法，检测5种肿瘤细胞中RASSF1家族中2种不同转录本mRNA的表达情况。结果表明，2种各转录本基因不仅是在不同肿瘤细胞中的表达有较大差异。而且在相同肿瘤细胞中的表达水平并不完全相同.由此提示可能肿瘤细胞存在该类基因的突变，同时说明这2种转录本基因可能与抑癌有关。但至于该基因家族7种转录本基因在同一肿瘤细胞中哪一种起主要作用,则需进一步通过基因表达的方法，提高各转录本基因的表达，可能获得更直接的实验证据。相关研究正在进行之中。

［1］Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigeneticinactivation of a ras association domain family protein from the lung tumorsuppressor locus 3p21.3［J］. NatGenet, 2000; 25(3):315-319.

［2］Shivakumar L, Minna J,Sakamaki T, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progressionand inhibits cyclinD1 accumulation［J］. Mol Cell Biol, 2002; 22(12):4309-4318.

［3］Newton AC.Seeing twodomains.Curr Biol,1955.5;973.976

［4］Hallberg B,Hayter SI,Downward J.Interaction ofRas and Raf in infect wammalian cells upon extracellular. J BiolChen,1994,269:3913-3916

［5］Whang-peng J, Kao SC, LeeEC, et a1. A specific chromosome defect associated with human small-cell lung cancendeletion3pl4-23[J]. Science, 1982, 215:181-182.