论文导读：而在6种玉米单倍体样品种子的胚部，有着能与加倍单倍体区分开来的可染色的紫胚标记。在本研究中，值得关注的是与6种单倍体的紫胚标记相关联的分子标记的探寻。
关键词：玉米，单倍体育种，分子标记
玉米的单倍体育种是一种利用孤雌或孤雄生殖的方式制造单倍体，然后通过自然或人工加倍的方式获得新品种的技术。如果把单倍体育种体系运用在转基因方面的研究中，则外源基因将在子代中得以稳定地遗传，并且不会发生性状分离。因此，单倍体育种能大大缩短育种周期[1]。
玉米单倍体技术主要有自然发生的单倍体、孤雌生殖、花粉、花药培养、传粉玉米子房诱导单倍体、远缘杂交单亲染色体消失、辐射诱导以及高频诱导单倍体材料等[2]。在获得玉米单倍体以后，需要进行单倍体鉴定确认，主要方法有：形态解剖学方法、细胞遗传学方法、生理生化法、射线照射法以及分子标记法等。论文格式。其中，以分子标记法最为准确可靠[3]。
在本研究中，在6种单倍体样品中存在紫胚标记。经过染色后，在其种子籽粒胚呈现深色的标记。而3种加倍单倍体经过染色却并未发生此种现象。紫胚性状是表现于籽粒胚部的当代性状, 可不借任何仪器进行直观识别[4]。因此，这种胚标记成为了一种有效的鉴定单倍体的手段。
然而，如果能够从分子水平入手，寻找到与紫胚标记相关联的分子标记，则单倍体的鉴定确认将达到一个更为可靠、准确、快捷、简便的水平。汤飞宇等利用SSR标记并结合大田农业形状，对玉米178X黄C杂交种子房培养的再生植株后代进行遗传分析，结果证明两个株系在随机检测的20个位点上均表现纯合，为自发加倍的双单倍体[5]。
而RAPD（随机扩增多态性DNA）作为一种基于PCR技术的快捷而简便的分子标记手段，被广泛应用于各种单倍体育种研究中。朱旭芬等从酿酒酵母的耐热菌株HU2TY21 中分离了单倍体HZ系列，并选取HZ221、HZ284 菌株进行RAPD的分析,显示单倍体菌株与它们的二倍体亲株以及原始出发菌株LK的基因组之间确实存在着多态性DNA 片段，其中有些可能与菌株的耐热性有关[6]。
分子标记技术已经应用到了玉米育种的许多环节,带来了前所未有的变革,真正实现了由表型选择向基因型选择的过渡。随着分子生物技术的飞速发展和不断完善,DNA分子标记技术必将为高精度种子纯度检测和品种鉴定展现出美好、广阔的前景[7]。
1 材料和方法1.1 材料从某农业种子公司取得的，包括3种玉米加倍单倍体样品：MWD 31, MWF 26, MWD 40; 和6种单倍体样品：SH17, SH 19, SH 20, SH 21, SH 27, SH 30.
而在6种玉米单倍体样品种子的胚部，有着能与加倍单倍体区分开来的可染色的紫胚标记。
1.2 方法（1）基因组DNA的提取。（试剂盒法提取，上海捷瑞生物工程有限公司）（许理文等采用试剂盒法提取玉米基因组DNA并取得了较好的结果[8]）
（2）RAPD与电泳处理。李尚禹等采用RAPD方法对6种玉米杂交种及其父母本的指纹图谱进行鉴别，得出了差异显著的图谱，说明RAPD可以用来进行玉米品种鉴定和纯度鉴定[9]
（3）电泳图谱的分析（琼脂糖凝胶电泳）
（4）根据筛选出的引物所扩增出的电泳条带构建出9种样品的亲缘关系树型图。（刘湘丹等采用RAPD技术对百合鳞叶基因组DNA的多态性进行分析，利用紫外凝胶成像系统通过对电泳图像分析建立了百合基因组DNA指纹图谱，并利用NTSYS软件进行品种品系间UPGMA聚类分析[10]）
2 结果分析表 1 从100个随机引物中筛选出的较理想的22个引物
Table 1 The 22 satisfied primers selectedfrom 100 random primers
| OPA 04 |
5’-AATCGGGCTG-3’ |
OPC 10 |
5’-TGTCTGGGTG-3’ |
| OPA 07 |
5’-GAAACGGGTG-3’ |
OPC 13 |
5’-AAGCCTCGTC-3’ |
| OPA 09 |
5’-GGGTAACGCC-3’ |
OPD 07 |
5’-TTGGCACGGG-3’ |
| OPA 12 |
5’-TCGGCGATAG-3’ |
OPD 13 |
5’-GGGGTGACGA-3’ |
| OPA 18 |
5’-AGGTGACCGT-3’ |
OPD 16 |
5’-AGGGCGTAAG-3’ |
| OPB 01 |
5’-GTTTCGCTCC-3’ |
OPD 19 |
5’-CTGGGGACTT-3’ |
| OPB 03 |
5’-CATCCCCCTG-3’ |
OPE 01 |
5’-CCCAAGGTCC-3’ |
| OPB 17 |
5’-AGGGAACGAG-3’ |
OPE 04 |
5’-GTGACATGCC-3’ |
| OPB 18 |
5’-CCACAGCAGT-3’ |
OPE 07 |
5’-AGATGCAGCC-3’ |
| OPB 19 |
5’-ACCCCCGAAG-3’ |
OPE19 |
5’-ACGGCGTATG-3’ |
| OPC 05 |
5’-GATGACCGCC-3’ |
OPF 01 |
5’-ACGGATCCTG-3’ |
部分引物的电泳图谱：1:MWD31, 2:MWD40, 3:MWF26, 4:SH17, 5:SH19, 6:SH20, 7:SH21, 8:SH27,9:SH30
图 1 引物OPA 04 的电泳图谱
Fig.1The electrophoresis picture of primer OPA 04
图 2 引物OPB 03 的电泳图谱
Fig.2The electrophoresis picture of primer OPB 03
遗传相似性分析：
表2 九个样品的遗传相似数值（GSC）
Table 2 The GSC of 9 samples
图 3 九个样品的亲缘关系图
Fig.3 Unweightedpair group-method with arithmetic mean (UPGMA) dendrogram of the whole 9samples
从表2和图3中可以看出，MWD31与MWD40拥有九个样品中最近的亲缘关系（GSC：0.64）。而SH20与SH21和SH17与SH30之间的GSC值仅有0.31，显示了较远的亲缘关系。论文格式。比较特殊的是MWF26与其他两个加倍单倍体样品之间亲缘关系较远，而与SH17较近（GSC: 0.51）。
3 讨论 根据从100个随机引物筛选出的22个理想的引物的电泳图谱中可以发现，OPA-04, OPA-09,OPB-03, OPB-18, OPC-05对于玉米基因组DNA是最佳选择。
在本研究中，值得关注的是与6种单倍体的紫胚标记相关联的分子标记的探寻。随着分子克隆与PCR技术的兴起，分子标记越来越被认为是发展潜力最大的生物标记手段。在本实验中，如果能够找到与其胚标记相关联的分子标记，则势必会使品种与亲缘关系的鉴定更加的简便、易行、快捷、准确，从而为相关农业生产研究的部门和公司带来巨大的经济效益。论文格式。
然而遗憾的是，实验中未能找到确凿且清晰的电泳图谱来证明其中的某条带与其紫胚标记有密切的关系。究其原因，可能是因为一些实验操作上的失误以及RAPD作为分子标记方法本身的一些缺陷，后者可能更加重要一些。比如可重复性差导致的前后结果不一致。因此在后续的实验中我们考虑使用精度更高，重复性更好的AFLP的方法[11]。
参考文献[1] 郭奕明，叶和春，郭仲琛，等.玉米的单倍体育种及基因转化的研究[D].2003，01，07.
[2] 姜昱，王玉民; 王中伟，等.我国玉米单倍体育种技术研究进展[J].玉米科学2007，15（5）.
[3] 赵延明，董树亭，张锁良.玉米单倍体育种技术研究与应用进展[J].玉米科学，2007，15（5）：60-64.
[4] 罗大刚.玉米紫胚标记性状的遗传及在无融合生殖研究中的应用[J].云南农业大学学报，1997，12（2）.
[5] 汤飞宇,丁菲,王国英.利用SSR标记检测来源于玉米孤雌生殖的双单倍体[J].江西农业大学学报，2004，26（6）.
[6] 朱旭芬,吴雪昌,林靓,等.耐高温酿酒酵母单倍体的RAPD分析[J].生物工程学报，2001，17（5）.
[7] 曹士亮,王成波.生物技术在玉米育种中应用的现状和展望[J].黑龙江农业科学，2008（3）：14-16.
[8] 许理文，适用于高通量电泳分析的玉米基因组DNA提取体系的建立[D].首都师范大学,2008.
[9] 李尚禹，陈阳，王春艳，等. RAPD技术在东北地区玉米品种鉴别上的应用[J].分子科学学报，2007，（03）.
[10] 刘湘丹.RAPD分子标记技术在中药材百合研究中的应用[D].湖南中医药大学，2007.
[11] 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M].北京：化学工业出版社，2005.
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