不同树龄苹果园土壤对苹果砧木的抑制作用及与土壤微生物群落的相关关系研究

论文导读:：本研究以平顶海棠（苹果砧木）为试验材料，以采集自清苑县4个不同树龄苹果园的土壤为对象，研究了不同树龄苹果园土壤对再植平顶海棠幼苗生长的影响。结果表明，在前茬树龄为3、8、15和24年苹果园土种植的平顶海棠幼苗比正茬土对照的平均株高分别减少31.22%、46.38%、57.66%和63.10%；再植平顶海棠幼苗地上部干重分别减少0.96%、57.58%、76.88%和78.10%；地下部干重分别减少40.38%、48.79%、64.03%和79.43%。在24年生苹果树土壤中再植海棠幼苗校正发病率达到了72.73%，而在3年生苹果树的土壤中再植海棠幼苗校正发病率只有18.18%。用16S rDNA 和18S rDNA特异引物，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增，通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）对不同树龄的苹果园土壤根际细菌和真菌群落结构的差异进行分析。结果表明，随着苹果树龄的提高，根际土壤中真菌种类和数量显著增加，而细菌的种类和数量则随着树龄的增加显著减少。
论文关键词：苹果再植病害，根际微生物，树龄，变性梯度凝胶电泳

 

据统计，2008年我国苹果种植面积为199.23万hm²，产量为2984.7万t，占世界苹果面积和产量的40%以上，居世界第一位^[1]。由于很多主产区大部分耕地都栽植了苹果，很难在新区域发展果树种植，苹果再植问题严重困扰着我国苹果主产区果业的可持续发展。以河北省为例农业论文，本研究组在2007和2008年调查发现，树龄在15年以上的苹果园已占到近70%，而苹果最佳的结果年龄一般不超过20年，表明果园更新换代问题已经非常紧迫。苹果树再植病（Apple replant disease，ARD）又称连作障碍或忌地现象，有的也叫再植障碍，得病植株表现为树势弱、叶片小、新梢细短、根系腐烂、根量减少、果实质量差等症状。据报道，果树再植病主要是由于土壤残毒、线虫、土壤根际有害微生物等影响造成^[2]。再植病害病因复杂，但众多的研究报道^[3~5]认为，土壤微生物对果树再植病害的发生发挥着重要作用^[6]论文开题报告范例。

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是一项用于DNA突变检测的电泳技术^[7]，近些年来已经被广泛应用于各种环境微生物的生态研究中，如高热温泉、湖泊、海洋、土壤和根际等^{[ 8]}。本文首先研究了随着苹果种植年限的延长，其根际土壤对于后茬再植平顶海棠幼苗的株高、生物量、发病率和病原真菌数量的影响农业论文，然后采用PCR-DGGE技术，以不同树龄苹果园土壤样品中土壤微生物的基因组总DNA为研究对象，通过比较土壤中原核微生物的16S rDNA和真核微生物的18S rDNA差异，研究了随着苹果树龄的增加土壤中微生物群落多样性的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料：花盆（10×12 cm）；海棠品种：平顶海棠(Malus robust Rehd.)

1.2 育苗：海棠种子用1%次氯酸钠表面消毒5分钟，然后在自来水下冲洗5分钟。4℃层积处理30 d以上，待种子露白后播种于灭菌的泥煤苔和珍珠岩混合基质上，定时浇灌Hoagland营养液。每6 d更换新的营养液，调节pH 6.0士0.2，培养温度（24士1)℃，12 h光照的培养室中生长。

1.3 土样采集和处理设置：土壤采集于河北省清苑县温仁村红富士苹果园，采集果园的树龄分别为3、8、15和24年。砧木为八棱海棠（Malus micromalus Makino)，土壤类型为黄褐土。对照土采集于苹果园附近未种植过果树的麦田。果园土样采集距苹果树干1.5 m，深10-30 cm范围内的根际土壤，五点随机取样农业论文，混匀、过筛，备用。对不同树龄果园土壤的肥力测定结果表明，土壤肥力与苹果树龄间没有明显相关性（表1）。将不同树龄苹果园土壤及对照土壤分装于直径12 cm花盆中，每盆装土1 kg。将在培养室中培养4周的平顶海棠幼苗移栽于不同处理的花盆中。每个处理4次重复，每6株幼苗作为一个重复论文开题报告范例。

1.4 土壤微生物总DNA提取和PCR扩增

1.4.1 土壤微生物总DNA提取和纯化

采用化学裂解法，称取 5 g根际土壤样品，按照化学裂解法的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取^[9]。为了避免土壤样品所含腐殖质杂质对PCR扩增反应的抑制作用，对土壤样品的基因组DNA粗提液进行了纯化。采用Takara公司凝胶试剂盒对5种土壤样品的基因组DNA粗提液进行了纯化。

表1 不同处理的土壤肥力对比

Table 1 Soilfertility of different treatments

1.4.2 DNA样品的PCR扩增

试验用引物设计参照文献[10～12]，引物序列见表2。真菌与细菌PCR条件反应体系(50 μL)：10×PCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl₂，上下游引物各0.4 μmol/L，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U农业论文，补充ddH₂O至终体积50 μL。

真菌普通PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸l min，35个循环；最后72℃延伸10 min。降落PCR(TD-PCR)反应程序为94℃预变性5 min，先10个循环(94℃变性30 s，退火温度从69℃到60℃，每个循环降低1℃，退火30 s，72℃延伸l min)，再于恒定退火温度59℃下进行18个循环(94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸l min)，最后72℃延伸10 min^[13]。

细菌降落PCR反应程序为94℃预变性5 min农业论文，先20个循环(94℃变性l min，退火温度从65℃到55℃，每个循环降低0.5℃，退火l min，72℃延伸3 min)，再于恒定退火温度55℃下进行10个循环(94℃变性l min，55℃退火l min，72℃延伸3 min)，最后72℃延伸10 min^[13]。

表2　本研究中使用的引物

Table 2　 Primer used in this research

Note: F, forward primer; R, reverse primer;Positions according to Escherichia coli 16S rDNA sequence
 

GC:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG

1.5 调查项目：

1.5.1株高：在生长环境一致的条件下，分别在移栽后1、2、3个月测量各处理海棠幼苗的株高，以明确不同树龄苹果园土壤对再植苹果砧木株高的影响。

1.5.2地上、地下部生物量：移栽3个月后，分别取海棠苗的地上和地下部，测量各部位的鲜重农业论文，再于50℃烘箱烘干至恒重，称干重，以确定不同树龄苹果园土壤对再植海棠幼苗生物量的影响。

1.5.3 发病率与分离病原真菌的数量：3个月后不同树龄各选10个根系，每个根系切取5段，在1/4 PDA上分离病原真菌，统计分离数据。

1.5.4 DGGE及凝胶成像分析：采集不同处理土壤中的总DNA，根据Muyzer 等^[12]的方法，用DGGE法检测土壤中微生物种群区系和数量。使用的电泳设备是Bio-RadD Gene 系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)论文开题报告范例。将PCR产物上样到8 g/100 ml聚丙烯酰胺凝胶上，60℃、110V下电泳5 h。聚丙烯酰胺凝胶变性梯度范围为35%至55%，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后用1:10000 SYBR Gold (Bio Probe Products，Rockland农业论文，ME，USA) 染色30 min，立即用凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)拍照。

1.6 数据统计与分析

试验结果用DPS (Date Processing System)软件7.05版进行统计分析，采用邓肯新复极差法测验（Duncan’sANOVA），在p=0.05和p=0.01水平上进行差异显著性分析。DGGE图谱中DNA 条带由凝胶成像系统分析软件Imaging and Analysis Software ( Windows / Macin tosh，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)识别和统计。

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