现代生物技术在海洋药物研究中的应用

基因敲除和基因导人技术是20世纪80年代后期利用基因重组技术发展起来的一门新技术，其技术基础是胚胎干细胞(ES细胞)的分离和体外培养技术，目前已广泛应用于动物病理模型和新药筛选模型的建立中。其机制是通过对一些重大疾病相关基因的认识，对一些模式动物(如小鼠等)的染色体进行操作，在其染色体中删除(deletion)或导入( transformation)这些基因，使动物发生性状上的改变(表现为相关疾病的症状)，此模型因更接近于临床疾病的表型，因而更适合于新药的筛选工作，具有筛选准确率高的特点。

3 海洋药物基因的克隆技术

一般来说，具有很高生物活性的物质在海洋生物体内是以微量的形式存在的，远远不能满足临床前药学研究的需要的。为获得足够的中试样品，一般可以通过细胞培养来发酵生产目的产物，由于目前有关海洋生物的细胞培养技术还不够完善，且实验室的条件与海洋生物生活的环境具有很大的差异，因此，为使培养的细胞能大量产生目的产物，还需要不断的摸索海洋生物细胞的培养方法和发酵条件；另一种可行的途径是通过现代基因工程技术获得大量表达的重组产物。

克隆新基因的方法有多种，在已知蛋白序列（如蛋白质的N－端序列）的情况下，一般可以根据其N－端氨基酸序列设计简并引物，利用RT-PCR和RACE-PCR方法从组织中获得该蛋白相对应的核苷酸序列。另一种克隆新基因的方法是根据已知其它陆生生物基因的保守序列设计引物，利用RT-PCR技术从生物组织的总RNA提取物中克隆目的基因，此方法在克隆亲缘关系较近物种的同源基因方面往往很容易获得成功，但是，由于陆生生物和海洋生物的亲缘关系很远，两者体内的蛋白基因在同源性方面可能不高，因此，在同源基因的克隆方面需要慎重。

最有效的新基因克隆方法是对生物特定组织的cDNA文库进行筛选。因此，插人的cDNA片段可表达产生融合蛋白，具有定的抗原性和生物活性，将分离到的天然蛋白通过杂交瘤技术获得单克隆抗体后，可通过抗原－抗体反应的方法从cDNA文库中筛选到目的基因;也可以用天然产物免疫小鼠或兔，获得通过减法杂交(Subtractivehybridization)或差异显示技术(DifferentialDisplay RT-PCR)获得生物体特定发育时期表达的基因或基因片段(需要通过文库筛选的方法获得。通过对它们的重组表达产物的活性研究，也可能获得具有药用开发潜力的药用蛋白或多肽。

最新研究进展有：将DNA微阵列技术在海绵细胞培养上进行了应用，构建了斑节对虾遗传连锁图谱，建立了海洋红藻EST，从海星卵母细胞中分离出成熟蛋白酶体的催化亚基，初步表明硬骨头鱼类IGF2I原E2肽具有抗肿瘤作用[8]； Ahsan等克隆了鳗鱼胰蛋白酶原基因；Richardson等克隆了东方的干扰素调节因子基因并分析了其基因组结构；Mitsuo等克隆了一种新的鳗鱼细胞色素P450cDNA；Maccatro等克隆了真鲷肌肉生长抑制因子基因[9]。

4 海洋药物基因工程

广义的海洋药物基因工程是指利用源自海洋的药物基因重组生产药用蛋白(或多肽)或以海洋生物作为“生物反应器”生产药用蛋白(或多肽)，因此，可按照供体基因的来源以及表达体系的不同，将其分为2个研究方向:其一是海洋药物基因的重组表达、其二是海洋生物反应器。

4.1 海洋药物基因的重组表达

利用现代生物技术，如基因工程、发酵工程以及细胞工程等技术，使得获得海洋活性多肽或蛋白不再依靠大量采集海洋生物。

近几年来的主要进展包括:McKenna等 [9]将IPNV病毒的A片段基因重组到Semliki森林病毒表达载体PSFV1上，获得了重组的IPNV蛋白; 秦松[2]等在克隆到别藻蓝蛋白(APC)基因后，利用DNA重组技术将该基因与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MBP)基因构建成嵌合基因，转化大肠杆菌后获得高效表达MBP-APC融合蛋白的基因工程菌株，该重组产物具有明显的抑制小鼠S180肉瘤的活性。

4.2 海洋生物反应器

海洋药物与其他生物药物一样都经历了三个发展阶段:(1)采集和加工野生资源;(2)人工栽培和养殖药源;(3)把药物基因转入易转化、生长快和表达率高的生物种类中表达。随着生命科学进入基因时代，第三个阶段的发展在加快。生物反应器( Bioreactor)一般是指利用固定化酶及固定化细胞高效生产产物的技术。

虽然海洋中任何一种生物都有可能作为表达外源药物基因的生物反应器，但实际上只有人们最了解的种类才便于进行这种分子克隆的操作至今在海洋生物中用得较多的是微藻，已有蓝藻红藻、绿藻和硅藻转化成功，其中，蓝藻分子生物学的研究近几年来一直处于整个生物学的前沿[10]。1994年我国和日本学者同年报道了在蓝藻中表达药物基因成功。十多年来中国科学院植物研究所与合作者们已在蓝藻中成功地表达了6个药物基因:人肿瘤坏死因子a、人表皮生长因子、人尿激酶原、人小肠三叶因子、人粒细胞集落刺激因子、人和小鼠的金属硫蛋白；同时，还对载体的启动子、终止子、SD序列等调控因子作了研究，使外源基因表达效率从国际上平均为可溶性蛋白的千分之几，提高到3.3%～5%[11]。

从现有资料来看，海洋天然产物在化学结构上既具有较大程度的新颖性，又具有较为复杂的多样性(不亚于陆生中药成分)。这不仅表明在物质基础方面海洋药物与陆生中草药有一定的共性，而且结构新、活性强、毒性低的海洋天然产物可直接作为开发新药的先导化合物。虽如此，海洋药物药源问题仍历史性地被带人21世纪。只有开辟新的资源领域，探索新的方法和技术，实现技术上的跨越，才有可能解决制约海洋药物产业化的瓶颈因素。就技术来说，生物系统筛选技术、海洋化学生态学、海洋生物基因组学、蛋白质组学、生物组合化学等学科、方法和技术的发展正是未来海洋药物研究开发实现技术跨越的基石。

纵观国内外海洋生物活性物质研究的成功范例，可以看出：资源学研究是基础；政府宏观指导与参与、企业积极介入，以及广大海洋学、医药学科研工作者精诚合作，使科研项目取得较大力度的支持，从而推动研究工作向纵深发展。

参考文献
[1] 郝方，张雪莲，张顺宝等. 生物技术在新药研发中的进展与展望. 宁夏医学杂志， 2005，27(2):142-143
[2] 张成武，刘宇峰，王习霞等. 螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL260 ，K2562和U2937 的生长影响[J ] . 海洋科学，2000，24 (1) :45.
[3] 吴梧桐，郭显，王友同. 防治肝病的鳖鱼肝刺激物质及其制备方法. 中国发明专利，发明专利证书:JL99114463.5，国家专利主分类号:COCK14-435
[4] 郭昱，吴梧桐. 鳖肝肽对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及免疫调节作用. 中国药学杂志. 2001.1: 44-46
[5] 龚宁波，张丽娟，古同男. 基因芯片技术在医药学研究中的应用. 中南药学，2005，3(1):35-37
[6] Scherf U，Ross DT，Waltham M，et al. A gene expression dadabase for the molecular pharmacology of cancer[J].Nat Genet，2000，24(3):236
[7] 武瑞，连学昭. 基因芯片技术在中药研究中的应用. 中兽医医药杂志，2005.(1):21-23
[8]The Abstract of 5th International MarineBiotechnology Conference (IMBC2000)，29 September-4 October，2000， Townsville， Australia.
[9]Chen T T. Marine Biotechnology[M]. New York: SpringerPress，2001.
[10] 施定基. 藻类基因工程制备重组药物. 第七届海洋湖沼药物学术开发研讨会.中国药学会海洋药物专业委员会编辑出版，大连，2001，212271
[11] 施定基，赵兴贵，邓元告等. 展望分子海洋药物学. 中国天然药物，2005，3(3):133-137
 

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